橄榄花椒油抗氧化、抑菌作用及贮藏特性的研究

肖岚，熊敏，幸勇，唐英明

(1.四川旅游学院 食品学院，成都 610100；2.四川五丰黎红食品有限公司，四川 雅安 625300；3.四川旅游学院 烹饪学院，成都 610100)

花椒是芸香科花椒属植物，其成熟果皮干燥后，味辛麻、香气浓郁，是川菜烹饪的传统香辛料，有“川味花椒之王”的美誉。同时，花椒也是《中国药典》中记载的常用中药材，具有降血压、抗癌、麻醉镇痛、防虫抑菌等功能[1]。花椒油是常见的花椒精深加工产品之一，具有花椒特有的香气和麻味，市售花椒油常采用食用油直接浸泡花椒制成，且常用食用油为纯菜籽油，浸泡生产工艺普遍为热浸提[2]。

橄榄油作为一种用途广泛的烹饪用油，既可作为各种凉菜的拌料用油，也是煎炸爆炒等的理想烹饪用油，因其在200～220 ℃不易发生氧化且不易渗入食物内部。同时，橄榄油作为一种高档保健食用油，富含不饱和脂肪酸 (油酸占55%～83%)、多酚类、谷甾醇、角鲨烯和维生素E等营养成分[3]。随着国内居民收入水平和生活品质的提高，橄榄油已在国内出现“普及”趋势。然而，初榨橄榄油挥发性物质独特，具有特殊的青草味[4]，部分国人不太能接受，因此，为方便中国消费者对橄榄油的食用，本团队已研发出橄榄花椒油并申请了专利[5]，且在试验的前期研究中采用气相色谱(gas chromatography， GC)和离子迁移谱(ion mobility spectrometry， IMS)的联用技术对橄榄调和油(掺入不同比例的菜籽油)制备的花椒油的挥发性风味成分进行了分析，根据指纹图谱及主成分分析获得橄榄油与菜籽油的最佳调和比例。与纯橄榄花椒油风味最为接近的是掺入90%橄榄油的花椒油；与纯菜籽花椒油风味最为接近的是掺入20%橄榄油的花椒油。为进一步获得橄榄花椒油的抗氧化、抑菌作用以及贮藏特性的基础数据，本研究以掺入20%橄榄油、90%橄榄油和100%橄榄油的花椒油作为研究对象，纯菜籽花椒油作为阳性对照，研究橄榄花椒油的贮藏性质，以及抗氧化、抑菌作用，为橄榄花椒油在市场上的推广提供了理论依据和数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

干红花椒：四川汉源贡椒；一级压榨菜籽油：成都市新兴粮油有限公司；冷榨初榨橄榄油：四川省广元市荣生源食品有限公司；α-生育酚试剂盒：苏州科铭生物技术有限公司；芦丁标准品、没食子酸标准品：美国 Sigma 公司；ABTS [2,2＇-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐]、DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、二甲基亚砜、异丙醇等：均为化学纯；其他化学试剂：均为国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司；大肠杆菌 (Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙门氏菌(Salmonella)：四川农业大学食品学院微生物实验室保藏菌株。

1.2 仪器与设备

Allegra 21R台式高速冷冻离心机 美国Beckman公司；UV-8000紫外可见分光光度计 上海元析仪器有限公司；电热恒温生化培养箱 上海鸿都电子科技有限公司；立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；生物安全柜 上海力申科学仪器有限公司；各规格移液器 德国Eppendorf公司；旋转蒸发仪 上海那艾仪器有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花椒油的制备

1.3.1.1 橄榄花椒油的制备

选取花椒并剔除花椒的杂质。初次浸泡：将花椒送入破碎机中铲破花椒表皮油胞，再加入常温橄榄油进行浸泡，获得冷浸橄榄花椒油。第一次分离：将初次浸泡产生的冷浸橄榄花椒油和花椒粒进行分离，将冷浸橄榄花椒油放入第一暂存设备中，将花椒粒分离出。高温浸泡：将第一次分离出的花椒粒与温度120～180 ℃的橄榄油进行高温浸泡，获得热浸橄榄花椒油和花椒的混合物。第二次分离：将热浸橄榄花椒油和花椒进行分离，将热浸橄榄花椒油放入第二暂存设备中。调配：将第一次分离产生的冷浸橄榄花椒油和第二次分离产生的热浸橄榄花椒油按一定比例进行混合。

1.3.1.2 纯菜籽花椒油的制备

采用四川五丰黎红食品有限公司的发明专利技术制备纯菜籽花椒油。花椒伴随植物油粉碎→搅拌→浸泡→过滤→分离→过滤→沉淀。生产工艺设备包括粉碎机、螺旋搅拌机、离心机、输油管、板框过滤机。油温控制在100～200 ℃，花椒油由花椒在植物油中的浸出物及其混合油液组成。

1.3.2 橄榄花椒油抗氧化作用的研究

1.3.2.1 抗氧化组分的测定

α-生育酚含量的测定采用α-生育酚试剂盒，参考试剂盒说明书进行检测；谷甾醇含量的测定参考 GB/T 25223-2010《动植物油脂 甾醇组成和甾醇总量的测定 气相色谱法》；角鲨烯含量的测定参考张东等[6]的方法；花椒油多酚含量的测定参考熊汝琴等[7]的方法；花椒油总黄酮含量的测定参考柴丽琴[8]的方法。

1.3.2.2 抗氧化指标的测定

参考李杰等[9]的方法，测定花椒油对 DPPH·、ABTS+·、·OH 的清除能力。参考 Ozkan G等[10]的方法测定总抗氧化能力，参考高亚妮等[11]的方法测定还原力。半抑制浓度值(IC50)的测定参考李杰等的方法，将花椒油使用二甲亚砜稀释成不同浓度(实验点≥5)，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0 mg/mL，分别测定其·OH 清除率、还原力、ABTS+· 清除率、DPPH· 清除率、总抗氧化能力。以样品浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制成曲线，根据曲线计算IC50值，IC50值越小，抗氧化能力越强。

1.3.3 橄榄花椒油抑菌作用的研究

1.3.3.1 菌悬液的制备

将实验室4 ℃斜面保存的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌划线接种于LB固体培养基中，在37 ℃、150 r/min培养24 h 后，用LB 液体培养基稀释至浓度为 106～107CFU/mL的菌悬液待用。

1.3.3.2 抑菌圈的测定

向LB固体培养基中分别加入0.2 mL 3种供试菌悬液，涂布均匀后贴上用不同质量浓度(0，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/mL)花椒油溶液浸泡过的无菌滤纸片，以二甲亚砜作为对照。将平板于37 ℃培养24 h后用十字交叉法测定抑菌圈直径[12]。

1.3.3.3 最小抑菌浓度的测定

测定各花椒油对 3 种试验菌株的最小抑菌浓度(MIC)，取 1 mL各质量浓度(0，0.125，0.250，0.500，1.000 mg/mL)的花椒油溶液，均匀涂布在含3种供试菌的平板上，以二甲亚砜作为对照，在37 ℃、150 r/min条件下培养24 h，观察细菌的生长情况，无菌生长的最低浓度为 MIC[13]。

1.3.4 橄榄花椒油贮藏特性的研究

采用方正等[14]的烘箱法(60 ℃)进行油脂加速氧化试验以评价橄榄花椒油的贮藏性能。各花椒油分别取100 mL分装于多个食品级聚乙烯瓶中，然后放入(60±1) ℃的恒温烘箱内，分别于第0，6，12，18，24，30 天取出样品，参照GB 5009.229-2016测定酸价，参照 GB 5009.227-2016测定过氧化值。

1.4 数据处理

试验数据经3次平行试验后得到，均以平均数±标准差表示，采用Excel和SPSS 19.0统计软件对数据进行统计处理和显著性分析，显著水平设为 P<0.05。

2 结果和分析

2.1 橄榄花椒油体外抗氧化作用分析

2.1.1 橄榄花椒油中抗氧化组分含量的分析

表1 橄榄花椒油中的抗氧化组分Table 1 The antioxidant components in olive Zanthoxylum oil

初榨橄榄油中含有的 α-生育酚约占所有生育酚的90%～95%左右，且α-生育酚的生物活性最好，是公认的有效抗氧自由基分子，故α-生育酚含量与橄榄油品质有密切关系。由表1可知，YJ花椒油中的 α-生育酚含量最高，为 12.35 mg/100 g，而 GL花椒油中的α-生育酚含量只有9.51 mg/100 g，但无显著差异(P>0.05)；另外，2-8花椒油中的α-生育酚含量(11.23 mg/100 g)高于GL花椒油。由以上结果可知，GL花椒油中的α-生育酚含量较低，且远低于四川广元青川县主栽的3个油橄榄品种初榨橄榄油的 α-生育酚平均值含量(28.78 mg/100 g)，可能是橄榄油中的α-生育酚在高温浸提花椒时发生氧化破坏，这与徐莉等[15]的研究结果一致，即α-生育酚对橄榄油的稳定性起了主要的抗氧化作用；此外，根据邓龙[16]报道的32种市售不同品牌、产地及加工工艺的菜籽油中α-生育酚含量在73.799～271.952 mg/kg可知，菜籽油中的α-生育酚含量低于初榨橄榄油，然而YJ花椒油中的α-生育酚含量高于GL花椒油，表明菜籽油中的α-生育酚可能较橄榄油更稳定。

根据邓龙等的报道，32种市售不同品牌、产地及加工工艺菜籽油的角鲨烯含量在1.746～31.005 mg/kg，可见橄榄油富含角鲨烯。本试验中的4个花椒油样品，GL角鲨烯含量最高(2912.11 mg/kg)，随着花椒油中橄榄油比例降低，角鲨烯含量降低，9-1与GL差异不显著(P>0.05)，而2-8、YJ中的角鲨烯含量均极显著低于9-1与GL(P<0.01)，这与橄榄油掺入的比例有密切关系，因为橄榄油中的角鲨烯含量远高于菜籽油。植物甾醇广泛存在于植物油中，具有良好的抗氧化、抑菌、降低胆固醇、抗溃疡、抗肿瘤等作用[18]。仇宏图等报道了7组菜籽油样品中谷甾醇含量在 351.78～608.39 mg/100 g；张东等报道了我国8个品种的初榨橄榄油的谷甾醇含量在100～300 mg/100 g；可见，菜籽油中的谷甾醇更高。由表1可知，YJ谷甾醇含量最高(26285 mg/kg)，2-8 次之(2546 mg/kg)，且均极显著高于 GL、9-1(P<0.01)。

橄榄油中主要的多酚类化合物有没食子酸、羟基酪醇、芦丁、阿魏酸、槲皮素，且羟基酪醇、芦丁、阿魏酸、槲皮素具有良好的抗氧化、抑菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[19]。向春蓉[20]报道了四川凉山州引进的8个品种油橄榄的初榨橄榄油的总多酚含量平均值为26.04 mg/kg，其中，克罗莱卡的总多酚含量最高，为180.21 mg/kg；张亮等[21]报道了不同制油工艺制得的菜籽油的总多酚含量在47.00～152.08 mg/kg；可见，菜籽油中的总多酚含量较高。由表1可知，GL总多酚含量最高(27.56 μg/g)，随着掺入菜籽油比例的增加，各花椒油中总多酚的含量呈降低趋势，但均无显著差异(P>0.01)，可能多酚对菜籽油的稳定性起了主要的抗氧化作用。黄酮是一类具有2-苯基色原酮(2-phenyl-chromones)结构的多酚类化合物，具有抗氧化、抗肿瘤等生物活性。由表1可知，GL总黄酮含量最高(1.96 mg/g)，随着掺入菜籽油比例的增加，各花椒油中总黄酮的含量呈降低趋势，但均无显著差异(P>0.05)。

2.1.2 橄榄花椒油体外抗氧化作用分析

抗氧化作用易受多方面因素的影响，仅凭单一的抗氧化指标评价花椒油抗氧化能力缺乏说服力，因此本试验选择多个不同的体外抗氧化指标对花椒油抗氧化能力进行评价。各花椒油的体外抗氧化能力的 IC50值见表2。

表2 橄榄花椒油的IC50Table 2 The IC50 values of olive Zanthoxylum oil

由表2可知，各花椒油均具有一定的体外抗氧化能力，这与李杰等的研究结果一致，然而，各花椒油的体外抗氧化 IC50值表现出较大差异，其中，各花椒油对 ABTS+·、·OH、DPPH·表现出较好的清除力，IC50值较小，而各花椒油的还原力、总抗氧化力较弱，IC50值较大。 GL清除ABTS+·的能力最强，IC50值为42.37 μg/mL，而YJ清除 ABTS+·的IC50值为57.42 μg/mL，差异不显著(P>0.05)；GL还原力最差，IC50值为134.15 μg/mL，而YJ为153.51 μg/mL，其差异不显著(P>0.05)。造成以上结果的原因可能与各抗氧化指标的测定原理有关，即与花椒油中的抗氧化组分的种类及含量有关。另外，由表2可知，随着花椒油中橄榄油比例的增加，其抗氧化能力增强，GL的各抗氧化指标的IC50值均最小，其中，GL对·OH的清除力显著优于YJ(P<0.05)。结合2.1.1对各花椒油中抗氧化组分检测结果的分析可推知，各花椒油体外抗氧化能力的差异与花椒油中α-生育酚、角鲨烯、谷甾醇、总黄酮、总多酚等抗氧化物质的含量有关。

2.2 橄榄花椒油抑菌作用的结果分析

2.2.1 橄榄花椒油抑菌效果

(1)研究了我国煤矿安全管理制度建设的效果，将我国近30年煤矿百万吨死亡率的发展变化划分为制度欠缺期与制度改善期2个阶段，通过直观分析得出安全管理制度改善期的安全生产状况明显好于制度欠缺期，煤矿百万吨死亡率从1984年到2016年下降了97.8%。

各花椒油对3种受试的食品常见致病菌的抑菌作用见表3。

表3 橄榄花椒油对受试菌的抑菌作用Table 3 The antibacterial effect of olive Zanthoxylum oil on tested bacteria

续 表

由表3可知，各花椒油对3种受试菌均有抑菌作用，说明花椒油具有广泛的抑菌作用，这与前人的研究报道一致[22]；比较抑菌圈大小，各花椒油对3种受试菌的抑菌作用强度为：大肠杆菌>金黄色葡萄球菌>沙门氏菌。各花椒油在不同浓度下对3种受试菌的抑菌作用存在差异，随着花椒油浓度的增加抑菌圈直径逐渐增大，说明花椒油对3种受试菌存在量效关系，其中，在4个花椒油中浓度为 8 mg/mL的花椒油与对照组差异均极显著(P<0.05)，以上研究结果与赵二劳等的报道一致。

此外，随着花椒油中橄榄油比例的增加，花椒油对3种受试菌的抑菌作用增强；比较抑菌圈大小，GL的抑菌作用最好，9-1次之，YJ的抑菌作用最差。可见，橄榄油有助于提高花椒油的抑菌作用，这与橄榄油中酚类化合物的含量及种类有关。橄榄油中的酚类化合物(橄榄苦苷苷元脱羧甲基、羟基酪醇和酪醇的二醛结构)已被证明在体外对3种食源性致病菌(大肠杆菌 O157∶H7、李斯特菌和沙门氏菌)具有抗菌作用，并且橄榄油中各种酚类化合物之间具有协同相互作用[23]。本试验中，各浓度的9-1花椒油对大肠杆菌的抑菌圈直径均大于同浓度GL花椒油，这可能与橄榄油、菜籽油以及花椒本身含有的酚类化合物的协同作用有关；另外，1.0 mg/mL 9-1 花椒油对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于同浓度GL花椒油，1.0，2.0，4.0 mg/mL的9-1花椒油对沙门氏菌的抑菌圈直径大于同浓度GL花椒油。

2.2.2 橄榄花椒油的最低抑菌浓度

各花椒油对 3 种受试菌的最小抑菌浓度(MIC)见表4。

表4 橄榄花椒油的最低抑菌质量浓度Table 4 The minimum inhibitory mass concentration of olive Zanthoxylum oil

由表4可知，GL对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的MIC分别是 0.250，0.500，1.000 mg/mL，9-1对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的 MIC 分别是 0.250，0.500，1.000 mg/mL，2-8对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的MIC分别是0.500，0.500，1.000 mg/mL，YJ对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的MIC分别是0.500，0.500，1.000 mg/mL。MIC越小说明样品的抑菌作用越强，抑菌效果越好。

2.3 橄榄花椒油加速氧化过程中的酸值、过氧化值分析

酸值、过氧化值常用来描述油样在加速氧化过程中的氧化动力学特征[24]。根据NY/T 2111-2011 《绿色食品 调味油》的规定，花椒油(即香辛料调味油)的酸值不能超过 3 mg/g(以KOH计)，过氧化值不能超过 7.5 mmol/kg。

表5 橄榄花椒油的酸值(以KOH计)Table 5 The acid values of olive Zanthoxylum oil (calculated by KOH)

由表5可知，各花椒油的初始酸值在0.90～1.19 mg/g之间，其GL花椒油最低，YJ花椒油最高，但均未超过3 mg/g，由此可见，花椒浸提用油对花椒油的酸值有影响，纯橄榄油用于花椒油生产有利于降低其初始酸值，这可能是因为橄榄油中游离脂肪酸较少。各花椒油在(60±1) ℃恒温烘箱内进行加速氧化，随着加速氧化时间的延长，GL 花椒油、9-1花椒油的酸值呈逐步上升趋势，而YJ花椒油、2-8花椒油呈波动性上升趋势，整个加速氧化过程中，各花椒油的酸值均未超过NY/T 2111-2011 《绿色食品 调味油》的规定。

表6 橄榄花椒油的过氧化值Table 6 The peroxide values of olive Zanthoxylum oil

由表6可知，第0天的GL花椒油、9-1花椒油的过氧化值均超过 7.50 mmol/kg，即超出NY/T 2111-2011《绿色食品 调味油》的规定，且 GL花椒油的过氧化值最高(9.67 mmol/kg)，极显著高于YJ花椒油(P<0.01)，显著高于2-8花椒油(P<0.05)；而第0天的YJ花椒油、2-8花椒油的过氧化值均小于 7.50 mmol/kg，即符合NY/T 2111-2011《绿色食品 调味油》的规定。以上结果表明，纯橄榄油用于花椒油的生产升高了花椒油的过氧化值；而纯菜籽油用于花椒油的生产有利于降低花椒油的过氧化值，这可能是因为橄榄油中不饱和脂肪酸含量较高。随着加速氧化时间的延长，各花椒油的过氧化值迅速升高，其中第12天的GL花椒油的过氧化值显著高于第0天的GL花椒油(P<0.05)，第12天、第30天的YJ 花椒油的过氧化值极显著高于第0天的YJ花椒油(P<0.01)，第12天的9-1花椒油的过氧化值极显著高于第0天的9-1花椒油(P<0.01)，第12天的2-8 花椒油的过氧化值极显著高于第0天的2-8花椒油(P<0.01)。加速氧化第12天时，各花椒油的过氧化值达到最高峰，随后下降再升高，第30天时，各花椒油的过氧化值又达到一个高峰，这可能是橄榄油及菜籽油本身的化学性质和化学组分影响花椒油的氧化稳定性，比如橄榄油中的β-胡萝卜素、植物多酚类等。

综上，用于花椒油生产的植物油种类对花椒油的氧化稳定性有显著的影响。以上结果显示，菜籽花椒油抵御自动氧化的能力较好，而橄榄花椒油抵御自动氧化的能力较差；油脂抵御自动氧化的能力反映了油脂的耐贮性[25]，即菜籽花椒油较橄榄花椒油更耐贮藏。

3 结论

本试验采用(调和)橄榄油浸提花椒制备调味花椒油，并对其抗氧化组分进行了测定，结果发现纯橄榄花椒油中的角鲨烯、总黄酮、总多酚含量最高，且角鲨烯含量极显著高于纯菜籽花椒油(P<0.01)、掺入20%橄榄油的花椒油(P<0.01)，而总黄酮、总多酚含量与纯菜籽花椒油、掺入20%橄榄油的花椒油的差异均不显著(P>0.05)。此外，纯菜籽花椒油中的α-生育酚含量最高，与掺入90%橄榄油花椒油的差异显著(P<0.05)；谷甾醇含量与纯橄榄花椒油、掺入90%橄榄油的花椒油差异均极显著(P<0.01)。应用 ·OH 清除力、ABTS+· 清除力、DPPH· 清除力、总抗氧化力、还原力评价橄榄花椒油的体外抗氧化作用，最终发现橄榄油能增强花椒油的抗氧化作用，制备花椒油的橄榄油比例越高，抗氧化作用越强；其中，纯橄榄花椒油与纯菜籽花椒油对·OH的清除力差异显著(P<0.05)，其他各组之间均不存在统计学意义(P>0.05)。通过测定花椒油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的抑菌效果，发现花椒油对受试3种食品常见致病菌均有抑制作用，掺入橄榄油的花椒油的抑菌效果优于纯菜籽花椒油；其中，纯橄榄花椒油与掺入90%橄榄油的花椒油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的 MIC 相同，分别是 0.250，0.500，1.000 mg/mL，然而掺入90%橄榄油的花椒油对受试3种菌的抑菌圈却大于纯橄榄花椒油。通过氧化加速试验检验纯橄榄花椒油、掺入90%橄榄油的花椒油以及掺入20%橄榄油的花椒油的贮藏性，并以纯菜籽花椒油作为阳性对照，结果发现，各橄榄花椒油的酸值与纯菜籽花椒油差异不显著(P>0.05)，然而，纯橄榄花椒油的过氧化值极显著高于纯菜籽花椒油(P<0.01)，显著高于掺入20%橄榄油的花椒油(P<0.05)，且第0天的纯橄榄花椒油、掺入90%橄榄油的花椒油的过氧化值均超出NY/T 2111-2011《绿色食品 调味油》的规定。综上，本研究结果表明采用橄榄油作为花椒油浸提用油能提升花椒油的抗氧化、抑菌作用，但是，橄榄油会降低花椒油的氧化稳定性，即降低花椒油的贮藏性。因此，从生产成本、产品风味、贮藏特性、抗氧化及抑菌作用等方面综合考虑，建议花椒油中掺入10%橄榄油。