调味香料丁香罗勒精油成分、抗氧化及抑菌活性

杜丽霞，占豪，姜子涛,*

(1.天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700；2.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134)

丁香罗勒(OcimumgratissimumL.)为属唇形科罗勒属植物。该植物在我国的东南部地区(如江西、江苏、福建、广东及云南等地)有大面积种植，北美、非洲和亚洲的热带和温带地区也有广泛分布。丁香罗勒及丁香罗勒精油(OGEO)具有特殊的香气，为重要的调味香料，特别是用于制作色拉、披萨、西餐和意大利菜肴。OGEO具有驱蚊虫、抑菌、抗炎和镇痛等活性[1-3]。在巴西、肯尼亚和印度等国对OGEO化学成分已有报道。然而，关于我国OGEO化学成分方面的研究却极少报道。作者在前文中综述了该精油的成分及其活性研究进展[4]。OGEO的主要成分是丁香酚(EG)，其也是丁香、罗勒、多香果等调味香料的主要成分[5-7]。EG在食品和化妆品行业中用作调味剂和芳香剂，具有抗氧化、杀菌抑菌等生物活性，因而备受关注[8-9]。

本文采用GC-MS技术鉴定了OGEO的化学成分，利用6种不同的方法测定了OGEO的清除游离基能力、抗氧化活性和抑菌活性。并与EG和抗坏血酸(Vc)以及常见的合成抗氧化剂二丁基羟基甲苯(BHT)和没食子酸丙酯(PG)的抗氧化活性进行了比较。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

OGEO：采用水蒸气蒸馏法制得，由江西天然香料公司提供(江西吉安)，精油含量>95%。铁氰化钾：天津化学试剂批发部；磷酸盐(PBS)和Vc：天津市凯通化学试剂有限公司；BHT：福晨(天津)化学试剂有限公司；PG：浙江省温州市瓯海精细化工公司；EG：上海飞祥化工厂；邻二氮菲：天津市四通化工厂。所用试剂均为分析纯。

Finnigan Trace DSQ GC-MS联用机(EI离子源、TR-5MS色谱柱30 m×0.25 mm×0.25 μm、Mainlib Library 和 Replib Library数据库) 美国Thermo Fisher公司；UV-2102PC型紫外可见分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司；970CRT型荧光分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 OGEO成分分析

利用GC-MS技术测定OGEO的化学成分。GC条件：采用程序升温控制柱箱温度，以15 ℃/min的升温速率使柱箱温度由50℃上升到280 ℃，然后恒温10 min。载气(He)流速为1.0 mL/min，进样量0.3 μL，分流比40∶1。MS条件：电子束能量70 eV；接口和离子源温度均为250 ℃；质量扫描范围14～450 m/z。

1.3 OGEO的抗氧化活性

1.3.1 普鲁士兰法

参照文献[10-11]所采用的普鲁士兰法，测定了OGEO的抗氧化活性。为便于说明和比较OGEO的抗氧化活性，分别利用EG、Vc、BHT和PG来替代OGEO，进行比较测定。

1.3.2 抑制脂质过氧化活性

1.3.2.1 硫氰酸铁(FTC)法

按照文献[12]的方法并适当改进，通过测定亚油酸在氧化过程中过氧化物含量的变化，来评价OGEO的抑制脂质过氧化活性。为便于比较，同时也测定了EG、BHT及PG的抑制脂质过氧化活性。

1.3.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)法

参照文献[12]的方法并适当改进。本法前期所用试剂及具体做法与FTC法一致。试液在恒温箱中反应10 d后，每天取该试液1 mL与20%三氯乙酸溶液1 mL混匀后静置20 min，再加2 mL 0.3% TBA溶液，混匀后置于沸水浴中反应10 min，冷却至室温后再以3000 r/min离心20 min，将离心后的上清液在532 nm下测定所生成的丙二醛(MDA)吸光度值，利用下式计算抗氧化活性：

抗氧化活性(%)=[(Ao-As)/Ao]×100%。

(1)

式中：Ao为参比的吸光度，As分别为添加OGEO、EG、BHT或PG后的吸光度。

1.3.3 清除H2O2能力

参照周宁等[13]的方法并加以改进，测定OGEO清除H2O2的能力。具体做法：以PBS缓冲液(0.15 mol/L，pH 7.4)配制20 mmol/L H2O2溶液。取1 mL浓度分别为20，40，60，80，100 μg/mL的OGEO溶液，分别加入2 mL H2O2溶液，混匀，反应10 min后，在230 nm处测定其吸光度值。按照式(1)计算清除H2O2的能力即抗氧化活性。

1.3.4 清除羟基自由基活性

参照文献[14-15]的方法测定OGEO清除羟基自由基的活性。具体做法：取5支10 mL的比色管，按照表1列出的加入量依次加入所需的试剂，混合均匀后，将上述5支比色管同时置于恒温水槽中，37 ℃水浴1 h，冷却至室温，然后在波长536 nm处测定吸光值。按照式(2)计算OGEO(或EG、BHT、PG和Vc)的羟基自由基清除率：

羟基自由基清除率(%)=(As-Ap)/( Ab-Ap)×100%。

(2)

1.3.5 总体抗氧化活性的测定

用稍加改进的Prieto等[16]的方法，具体操作同文献[11]。对OGEO及EG的总抗氧化活性进行测定，并将测定结果与BHT及PG的总抗氧化活性结果进行比较。

1.4 OGEO的抑菌活性

1.4.1 抑菌直径

OGEO及EG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径的测定参照文献[11]和文献[17]进行。

1.4.2 最小抑菌浓度(MIC)

OGEO及EG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌MIC的测定参照文献[11]和文献[18]进行。

2 结果与讨论

2.1 精油成分分析结果

按选定的GC-MS条件对OGEO进行了分析。利用计算机标准谱库对比法和保留指数法，从OGEO中鉴定出15种成分，占精油总量的99.62%。OGEO的化学成分及其含量见表2。

表2 丁香罗勒精油(OGEO)的化学成分Table 2 The chemical components of Ocimum gratissimum L. essential oil (OGEO)

2.2 OGEO的抗氧化活性

2.2.1 普鲁士兰法

OGEO、EG、BHT、PG和Vc 5种化合物的抗氧化活性见图1。化合物提供电子能力的大小，直接反映了其抗氧化活性的强弱。化合物提供电子的能力越强，将铁氰化钾还原为亚铁氰化钾，进而形成普鲁士兰的能力也就越强，溶液在700 nm下的吸光值也就越大，化合物的还原能力越强。由图1可知，OGEO、EG、BHT、PG和Vc的抗氧化活性随着浓度的增加而增加。分别对测定结果进行曲线拟合，得到OGEO、EG、BHT、PG和Vc的半抑制浓度(IC50)分别为175.8, 148.6，195.0，89.0，100.2 μg/mL。可见利用普鲁士兰法得到的OGEO等5种化合物的抗氧化活性顺序为PG>Vc>EG>OGEO>BHT。

图1 不同浓度下OGEO等化合物的抗氧化活性Fig.1 The antioxidant activities of OGEO and other compounds at different concentration

2.2.2 抑制脂质过氧化活性

2.2.2.1 硫氰酸铁法(FTC)

利用FTC法测得的OGEO、EG、BHT和PG的抑制脂质过氧化活性见图2。吸光值越小，表明化合物的抗脂质过氧化活性越强，其活性顺序为OGEO>EG>BHT>PG。由此得出OGEO抑制脂质过氧化物产生的能力要比常见的合成抗氧化剂BHT和PG稍微强一些。而作为OGEO的主要成分EG减少脂质过氧化物产生的活性比OGEO的活性还弱一些。由此可见，OGEO中能够减少脂质过氧化物产生的主要成分除EG外，还有其他的化学成分，有待于进一步研究。由图2可知，起初4种化合物抑制脂质过氧化活性曲线变化明显；但反应6 d后，随着反应时间的延长，抑制脂质过氧化活性曲线变化不大，说明OGEO、EG、BHT和PG抑制脂质过氧化物的能力均比较稳定，基本上趋于平缓，不受到时间的影响。

图2 OGEO等化合物抑制脂质过氧化活性Fig.2 The lipid peroxidation inhibition activities by OGEO and other compounds

2.2.2.2 硫代巴比妥酸(TBA)法

利用TBA法测定OGEO、EG、BHT和PG抑制脂质过氧化结果,见图3。可以看出OGEO、EG、PG和BHT抑制脂质过氧化物产生的能力依次为OGEO>EG>PG>BHT。与FTC法的结果一样，OGEO抑制脂质过氧化物产生的活性要比常见的合成抗氧化剂BHT和PG的活性稍强一些；同样地，作为OGEO主要成分的EG其抑制脂质过氧化物产生的活性也比OGEO稍弱一些。这一结果进一步证实了OGEO中抑制脂质过氧化的活性成分不仅仅是EG。

TBA与FTC有较多相似之处，实验所用仪器、试剂及实验要求条件大致相同，不同之处在于两种方法所用的显色剂。两种方法测定抑制脂质过氧化物活性的比较结果见图3，可见两种方法还是非常相似的。

图3 FTC和TBA法比较OGEO、EG、BHT和PG抑制脂质过氧化活性Fig.3 Comparison of lipid peroxidation inhibition activities by OGEO, EG, BHT and PG using FTC and TBA methods

2.2.3 清除过氧化氢能力

在生物体内，超氧化物歧化酶等氧化酶的酶促反应常常形成H2O2，其能透过细胞膜进入细胞内，使细胞内一些酶的巯基氧化失活。OGEO、EG和BHT清除H2O2的结果见图4，与合成抗氧化剂BHT进行比较，OGEO及EG均显示出较强的H2O2清除能力，清除率顺序为EG>OGEO>BHT，当OGEO、EG和BHT的浓度均为80 μg/mL时，三者对H2O2的清除率分别为71.3%、79.4%和37.6%。这一结果表明OGEO和EG清除H2O2的能力均大于BHT，这是由于精油分子比BHT更容易透过细胞膜进入细胞内。因此，OGEO和EG有较强的清除H2O2能力。

图4 OGEO、EG和BHT清除H2O2的活性Fig.4 The H2O2 scavenging activities by OGEO, EG and BHT

2.2.4 清除羟基自由基活性(邻二氮菲法)

OGEO清除·OH的活性见图5中(A)。为了便于比较，我们将EG、BHT、PG和Vc清除·OH活性的测定结果也一并显示在了图5(A)中。由图5中(A)可知，OGEO、EG、BHT、PG和Vc均能有效地清除·OH游离基，这也是它们均具有抗氧化活性的原因所在。由于5种化合物的用量是相同的，所以OGEO清除·OH的活性最强，比常见的抗氧化剂BHT、PG和Vc都高，清除率达到73.0%；而Vc的清除率最低，仅为30.0%。清除·OH自由基活性顺序为OGEO>EG>BHT>PG>Vc。由此可见，天然抗氧化剂清除·OH的能力优于合成的抗氧化剂。而作为OGEO中的主要成分EG，它对·OH的清除率(61.1%)不及OGEO本身，这说明OGEO中可能存在着清除·OH自由基活性比EG还要强的化学成分。OGEO清除·OH自由基活性的结果是精油中化学成分协同作用的体现。

图5 OGEO等5种化合物清除羟基自由基的活性(A)及OGEO和EG在不同浓度下清除羟基自由基的活性(B)Fig.5 The scavenging activities of hydroxyl radical by OGEO and four other antioxidants (A) and scavenging activities of hydroxyl radicals of OGEO and EG at different concentration (B)

由图5中(B)可知，OGEO和EG清除·OH自由基活性(Y)与它们的浓度(X)有较好的线性相关性(相关系数R分别为0.992和0.986)。根据二者清除率与浓度的相关曲线可知，OGEO和EG的IC50值分别是80.0 μg/mL和157.4 μg/mL。

2.2.5 总体抗氧化能力

将OGEO、EG、BHT及PG的总抗氧化活性进行比较，结果见图6。OGEO及EG的总抗氧化活性均比BHT及PG的强一些，其中EG的总抗氧化活性最强，而EG为OGEO的主要成分，这说明EG在精油抗氧化过程中发挥了重要的作用。

图6 OGEO及EG等化合物的总体抗氧化活性Fig.6 The total antioxidant activities of OGEO, EG and other compounds

2.3 OGEO及EG的抑菌活性

OGEO和EG对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径的测定结果见表3。实验中所用的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均是非常常见的实验模式菌株，前者为杆菌，后者为球菌，二者的实验承受力也有所不同，利用这两种菌株落实抑菌实验具有实际意义。

表3 OGEO和EG的抑菌能力Table 3 The bacteriostatic abilities of OGEO and EG

由表3可知，OGEO和EG对这两种细菌均具有抑制作用，并且EG的抑菌圈直径略大于OGEO。植物精油普遍具有抑菌活性，活性大小与精油成分的分子结构密切相关。萜烯类和萜烯类含氧衍生物均具有一定的抑菌活性，其中酚类化合物的抑菌活性最强，例如前述的EG。由GC-MS分析结果可知，OGEO 中占主导成分的是EG，这使OGEO 和EG均具有很好的抑菌效果，并且EG的抑菌效果大于OGEO。

表4 OGEO和EG的最小抑菌浓度Table 4 The minimum inhibitory concentration of OGEO and EG

由表4可知，OGEO和EG对大肠杆菌的MIC为0.16 mg/mL，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.31 mg/mL，对这两种微生物的抑菌圈直径分别为13.0 mm和12.5 mm。Knobloch等[18]认为精油的溶解度与精油中有效成分透过细胞进入菌体的能力直接相关，而抑菌性则基于抑菌剂在菌体细胞膜双层磷脂中的溶解度。精油中的萜类能够降低生物膜的稳定性，从而干扰了能量代谢的酶促反应。OGEO中的抑菌成分EG起着重要作用，考虑到EG为萜类物质，由于萜类物质的结构同抑菌性有一定关系，尽管萜类物质的抑菌机理还需进一步研究，但实验结果为进一步对抑菌机制的研究提供了一定参考依据。

3 结论

利用GC-MS技术鉴定了OGEO的化学成分；并利用普鲁士兰法、硫氰酸铁法、硫代巴比妥酸法、清除H2O2能力、清除羟基自由基活性、总体抗氧化活性6种不同的方法测定了OGEO的抗氧化活性；初步阐述了精油主要成分与抗氧化活性的相关性。从结果来看，OGEO具有一定的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂使用。不同抗氧化活性的测定方法，反映的是化合物抗氧化活性的不同方面，其抗氧化机理也有所不同。因此，同时利用几种不同的方法来评价OGEO的抗氧化活性，结论更客观、更全面、更具有科学性和实际意义。天然抗氧化剂除了具有合成抗氧化剂不可比拟的安全优势外，在某些方面更优于合成抗氧化剂[19-20]。OGEO对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制能力也较强，其来源丰富，富含EG，预计丁香罗勒在天然食品抗氧化剂和防腐保鲜中有很好的应用前景。