柱后衍生阳离子交换色谱法测定酱油中38种游离氨基酸含量

李巧琪，许志彬，黄伟乾，李秀英

(广州检验检测认证集团有限公司 国家加工食品质量检验中心(广东)，广州 511447)

酱油是中国传统家庭最常见的调味品之一，有独特的酱香味，含有甜、苦、咸、酸、鲜5种滋味，酱油的甜、苦、鲜味主要来源于酱油中的游离氨基酸[1]，其与共存于酱油中的多肽构成了酱油独特的风味[2-3]，它们含量的高低也成为判定酱油等级的重要指标[4]。目前，国标中对酱油多肽含量的检测一般是通过检测酱油中酸溶蛋白的含量及游离氨基酸的含量计算得出[5-6]，其中考察游离氨基酸的含量为关键步骤，但目前只对16种游离氨基酸进行了检测，为了更全面地考察更多种类型的游离氨基酸对酱油中多肽含量的检测以及对酱油风味的影响，建立一种同时测定酱油中38种游离氨基酸含量的检测方法是十分必要的。

高效液相色谱-质谱法[7-8]检测游离氨基酸无需衍生，前处理简单，具有高选择性和高精度，但仪器成本昂贵。液相色谱法[9-11]得到最广泛运用，但其前处理复杂，部分衍生产物稳定性较差。气相色谱法[12]、气质联用法[13]衍生条件苛刻，不同氨基酸衍生反应速度不同或衍生试剂不同。离子色谱法[14]细菌干扰性强，基质影响大。其他方法如毛细管电泳法[15]、电位法[16]重现性较差。本文建立了一种可以快速除杂，并有效分离38种游离氨基酸的柱后衍生阳离子交换色谱法，该方法稳定，可用于日常酱油游离氨基酸的检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酱油：市售。

盐酸、无水柠檬酸、一水氢氧化锂、无水乙醇、氯化锂、硼酸、三氯乙酸、磺基水杨酸、苦味酸、苯酚(均为分析纯)：广州试剂厂；钾钠缓冲液、茚三酮(均为分析纯)、40种氨基酸混标(浓度为2.5 μmol/mL)：德国赛卡姆公司；甲醇(色谱纯)：弗舍尔公司；高纯氮气：大连大特气体有限公司。

1.2 仪器与设备

S433D型氨基酸分析仪 德国赛卡姆公司；D3024R型高速冷冻台式离心机 赛洛捷克公司；MS3涡旋混匀器 德国艾卡公司；ME204E型电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

称取约2 g酱油于50 mL离心管中，加入30 mL无水乙醇，涡旋振荡2 min后，定容至50 mL后置于-20 ℃冰箱中冷冻30 min, 于4 ℃下以12000 r/min离心20 min。取1 mL上清液用0.02 mol/mL盐酸定容至10 mL，摇匀后过膜上机。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 标准溶液的配制

临上机前，取标准液分别稀释至10，50，100，200，250 nmol/mL。

1.3.2.2 锂缓冲系统溶液的配制

缓冲液A：称一水氢氧化锂5.04 g、无水柠檬酸15.0 g于1 L烧杯中，加入50 mL无水乙醇、7.8 mL盐酸，加入适量水溶解后定容至1 L，将溶解pH调至2.9，过膜后使用。

缓冲液B：称氯化锂4.2 g、一水氢氧化锂8.4 g、无水柠檬酸15.0 g于1 L烧杯中，加入8.6 mL盐酸，加入适量水溶解后定容至1 L，将溶解pH调至4.2，过膜后使用。

缓冲液C：称硼酸10.0 g、氯化锂4.2 g、无水柠檬酸10.0 g、一水氢氧化锂8.4 g于1 L烧杯中，加入3.3 mL盐酸，加入适量水溶解后定容至1 L，将溶解pH调至8.0，过膜后使用。

再生液D：称19.5 g一水氢氧化锂于1 L烧杯中，加入适量水溶解后定容至1 L。

1.3.2.3 衍生液的配制

称取茚三酮20 g、苯酚2 g于烧杯中，加入钾钠缓冲液400 mL、甲醇600 mL，溶解后过膜置于棕色瓶内保存。

1.4 色谱条件

色谱柱为LCA K07/Li柱；衍生系统流速为0.25 mL/min，缓冲系统流速为0.45 mL/min；检测波长为440 nm(脯氨酸、羟脯氨酸)、570 nm(其余氨基酸)；进样量为50 μL。

1.4.1 梯度洗脱条件

梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 The gradient elution conditions

1.4.2 梯度柱温程序

梯度柱温程序见表2。

表2 梯度柱温程序Table 2 The gradient column temperature program

2 结果与分析

2.1 缓冲溶液体系的确定

氨基酸与离子交换树脂中磺化苯乙烯-二乙烯基苯聚合物的磺酸基结合而保留在色谱柱中，随着缓冲系统pH值和离子强度的逐步升高，依次达到不同氨基酸的等电点，磺酸基被碱金属阳离子所顶替，随流动相依次流出得到分离。实验分别用了钾、钠、锂系统对38种不同氨基酸进行洗脱分离，发现钾离子的洗脱能力远远大于钠离子和锂离子，38种氨基酸几乎被一次洗脱出来，不适用氨基酸的分离检测。而钠离子的洗脱能力稍强于锂离子，大部分氨基酸能够得到有效分离，但部分氨基酸仍无法有效地分离，如谷氨酸和谷氨酰胺、甲基组氨酸的同分异构体等出现重叠出峰的现象，因此，本实验采用了锂离子系统缓冲体系对38种游离氨基酸进行分离，利用各缓冲溶液不同的pH值和离子强度的差异逐步提高缓冲系统的洗脱能力，从而使38种氨基酸均能得到有效分离，洗脱程序见表1，洗脱效果色谱图见图1。

图1 38种氨基酸标准色谱图Fig.1 The standard chromatogram of 38 kinds of amino acids

2.2 沉淀溶剂的选择

酱油存在一定量的蛋白质和短肽，对氨基酸的分离造成一定的干扰，需要进行除杂。磺基水杨酸、三氯乙酸、苦味酸、乙醇常作为沉淀剂用于沉淀样品中蛋白质、短肽，本文采用加标浓度比50 nmol/mL的酱油考察了不同沉淀剂(3%磺基水杨酸、3%三氯乙酸、3%苦味酸、无水乙醇)样品杂质的除杂效果，分别平行测定6次，结果见图2。

图2 不同沉淀剂对氨基酸回收率的影响Fig.2 The effect of different precipitants on the recovery rates of amino acids

由图2可知，无水乙醇的净化效果最好，而使用其他3种试剂作为沉淀剂，会出现试剂杂质峰，影响基线，特别是使用磺基水杨酸和苦味酸时净化效果较差且回收率较低。当采用无水乙醇作为沉淀剂时，实际样品的净化效果见图3。

图3 实际分析样品色谱图Fig.3 The chromatogram of actual analysis samples

由图3可知，样品基线较平整，杂质峰少，目标峰分离效果良好，表明无水乙醇的净化效果好。

2.3 线性范围和检出限

38种氨基酸的线性范围、相关系数和检出限见表3。结果显示，38种氨基酸在10～250 nmol/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数大于0.9990。

由于酱油均为氨基酸阳性样品，方法检出限无法采用阴性样品进行试验，本研究采用目标峰附近30个数据点2倍基线噪声值峰高乘以样品含量，再除以峰高计算方法检出限，结果见表3。38种氨基酸方法检出限介于1.5～19.0 mg/kg，相比酱油中游离氨基酸含量，方法检出限远远小于含量，表明方法的灵敏度满足检测要求。

表3 38种氨基酸线性范围、相关系数、检出限Table 3 The linear ranges, correlation coefficients and detection limits of 38 kinds of amino acids

2.4 回收试验

采用3个浓度比水平进行样品加标，使最终上机样品液加标浓度比为50，100，200 nmol/mL，按本研究建立的方法平行测定6次，结果见表4。

表4 回收试验结果Table 4 The results of recovery experiments

续 表

由表4可知，在50，100，200 nmol/mL加标水平下，方法的平均回收率介于89.6%～100.8%，相对标准偏差介于1.7%～7.2%，方法的稳定性和精密度满足分析检测要求[17]，表明该方法适用于酱油中38种游离氨基酸的测定。

3 结论

建立了一种同时测定酱油中38种游离氨基酸的柱后衍生阳离子交换色谱法。样品采用了乙醇和冷冻沉淀物进行双重净化，离心后取上清液经阳离子交换色谱柱分离，与茚三酮衍生反应，于440，570 nm处检测。实际样品分析表明，本法净化效果良好、前处理简单、灵敏度高，适用于酱油中38种游离氨基酸的定性定量分析。