ε-聚赖氨酸抗菌特性及应用研究进展

柳芬芳，李迎秋

(齐鲁工业大学(山东省科学院) 食品科学与工程学院，济南 250353)

常见的天然防腐剂有大豆碱性多肽、壳聚糖、纳他霉素、ε-聚赖氨酸等[1-2]。ε-聚赖氨酸(ε-PL)作为一种新型的天然抑菌剂已经被广泛应用于食品保藏。ε-PL，又称25～30个赖氨酸残基的阳离子均聚物，分子量约为5000 kDa，由链霉菌好氧发酵产生[3]。ε-PL为淡黄色粉末，是一种食品添加剂，具有水溶性、食用性、对人体无毒、高温稳定、生物降解性好等特点，可以承受一般食品加工中的热处理[4]，被FDA批准为公认的安全(GRAS)剂[5-6]。早在2003年，ε-PL就被FDA批准应用于食品保藏，并逐渐在美国、韩国和日本得到广泛的应用。我国也于2014年将ε-PL纳入食品添加剂使用范畴，具有广泛的应用前景[7]。ε-PL可分解为赖氨酸，对人体无任何副作用，是一种赖氨酸来源且应用广泛。

ε-PL对大多数革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌和病毒具有广谱抗菌活性。据报道，极少量(100 mg/mL)的ε-聚赖氨酸足以达到对许多致病细菌的最低抑制浓度(MIC)[8]。因此，ε-PL可作为食品中的天然食品添加剂，也可作为日常食品及其生产设备中抗单核细胞增生杆菌的消毒剂。李诚等在ε-聚赖氨酸抑菌性能的研究中表明ε-聚赖氨酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黄曲霉、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、保加利亚乳杆菌6种供试微生物均有一定的抑制作用。与化学防腐剂相比，ε-PL因具有高效、低毒的优势而深受生产者青睐[9]。

1 抗菌特性及效果

ε-PL对不同菌种的最小抑菌浓度见表1和表2，菌种不同，最小抑菌浓度不同。造成这种现象的原因可能是制备ε-PL的环境不同，制备步骤有所不同；另一种原因可能是不同的菌种有不同的活性，具有不同的结构。

表1 ε-PL对不同细菌的最小抑菌浓度Table 1 The MICs of ε-polylysine to different bacteria

表2 ε-PL对不同真菌的最小抑菌浓度Table 2 The MICs of ε-polylysine on different fungi

李诚等对ε-PL的抑菌性进行了研究，对抑制常见微生物的效果进行了比较。研究表明，ε-PL对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、保加利亚乳杆菌的抑菌效果较好，对黄曲霉的抑菌效果较差，且加热后对抑菌效果影响不大。研究还发现，ε-PL和甘氨酸、Nisin复配后，由于协同作用，抗菌效果明显增强。倪清艳等经过发酵后得到粗制ε-PL，测定了其对常见菌的抑菌特性，结果表明ε-PL具有广谱抗菌性。G+菌、G-菌和真菌经过ε-PL处理后生长都受到了一定的抑制，且加热后对抑菌效果影响不大。

2 抗菌机制

2.1 ε-PL对白色念珠菌的作用机制

余甜等用不同浓度的ε-PL处理白色念珠菌浮游菌株，研究其的抑菌活性。结果表明，ε-PL的抑菌效果呈浓度依赖性，对浮游菌株和生物膜的抑菌作用明显。白色念珠菌的毒力主要依靠它的菌丝，从而导致病菌感染。衡量ε-PL对白色念珠菌菌丝的抑制作用体现在它的出芽率和芽管长度。结果表明，低浓度对菌丝没有明显抑制作用，在最低抑菌浓度和最小杀菌浓度下ε-PL对白色念珠菌的芽管出芽率和长度有明显的抑制作用，并且呈现剂量依赖性。本实验还研究ROS的氧化损伤与ε-PL浓度的关系。白色念珠菌产生的ROS含量与ε-PL剂量浓度呈正相关。MDA是一个重要指标，是膜脂质过氧化的主要产物，也是膜系统遭受压力的标志。研究表明，ε-PL可以引起菌膜出现脂质过氧化损伤且与浓度无关，ROS和MDA含量与ε-PL的剂量浓度有关。在加入抗氧化剂后，MDA含量均出现了显著下降。经ε-PL处理过白色念珠菌后导致菌体内产生过量ROS，ROS对细胞膜有胁迫作用，随着丙二醛含量增加，丙二醛可以与核酸和蛋白质反应，从而改变菌体的结构和生物学特征，引发抑菌作用。

2.2 ε-PL对柑橘酸腐菌的作用机制

肖媛等[12]研究了ε-聚赖氨酸对柑橘酸腐菌的抑菌活性及作用机制，发现柑橘酸腐菌菌丝体生长和孢子萌发率的抑制作用随着ε-PL剂量浓度的升高而增强，呈现出明显的量效关系。细菌细胞膜可以保护细胞免受周围环境的侵害，并负责运输细胞生长和代谢所必需的营养素。一旦细胞膜受损，细胞内的电解质渗漏到培养液中，致使培养液的电导率升高，细菌的生长和代谢就会被破坏、被抑制。ε-PL处理可以加快菌丝体的胞外电导率上升，且上升趋势与ε-PL的处理时间和浓度有关，呈正相关。当菌体处于不利环境中时，随着浓度的增加，细菌受到的破坏更严重，并且大多数细胞膜不再完整，细菌被透明化，内容物K+、PO43-等小离子物质和DNA、RNA等大分子物质被释放出来。随着ε-PL浓度的增加，细胞内含物的泄漏速率也增加。病原菌菌丝体形态的改变是抑菌活性物质重要的作用途径，柑橘酸腐菌的菌刚开始表面光滑且完整，随着处理剂量浓度的增加，菌丝体表面变得粗糙、有褶皱，最后崩溃、坍塌，内容物泄露。

2.3 ε-PL对李斯特氏菌的作用机制

革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞膜成分的完整性是决定细菌存活的关键因素。Lin Lin等研究了ε-聚赖氨酸对单核细胞增生李斯特氏菌的抗菌机理，发现ε-PL对单核细胞增生李斯特氏菌细胞膜有破坏作用。未经处理的细菌似乎具有天然和完整的细胞结构。经过ε-PL处理的细菌的外膜从细胞质上剥离下来，导致细胞内含物泄漏。细菌细胞膜受损的原因可能是ε-PL在单核细胞增生李斯特氏菌表面上的静电吸收。它导致外膜剥离和细胞质分布异常，导致细胞生理受损。细胞膜通透性的增加可能是由ε-PL与细胞膜之间的相互作用引起的。ε-PL破坏细胞膜并抑制ATP酶活性，从而导致细胞内部和外部ATP平衡的丧失。未处理的单核细胞增生李斯特氏菌的条带明显且集中，而处理的细胞条带模糊且分散。ε-PL对己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶以及EMP途径具有破坏作用。此外，EMP途径和RM的阻滞导致ATP、NADH和生物量减少，最终造成细菌的凋亡。ε-PL对单核细胞增生李斯特氏菌的呼吸代谢具有抑制活性，直接反映了能量的产生和生物量的积累。

2.4 ε-PL对酿酒酵母的作用机制

薄涛等[13]研究发现，ε-PL对酿酒酵母的抑菌作用呈浓度依赖性。当ε-PL的剂量少于200 μg/mL时对酿酒酵母生长的抑制作用不大，当剂量为200～500 μg/mL时酿酒酵母的生长受到明显的抑制作用，而当剂量大于500 μg/mL时可使酿酒酵母死亡。经过浓度为500 μg/mL的ε-PL处理后细胞表面会皱缩并出现孔洞，进而造成磷脂双分子层的弯曲。

Tan Zhilei等[14]研究了ε-聚-L-赖氨酸对酿酒酵母细胞壁的影响及其抗菌机制。众所周知，磷酸甘露糖基是酿酒酵母细胞壁中甘露糖蛋白的主要成分。ε-PL显著影响细胞壁的组成，如β-1,3-葡聚糖、甘露糖基磷酸酯和几丁质，从而使细胞壁更脆弱，通透性显著增加。此外，ε-PL诱导了酿酒酵母细胞内活性氧(ROS)的积累，并致使DNA断裂。ε-PL处理菌体后导致原生质通过孔泄漏，最终导致细胞死亡。这些结果表明ε-PL可能具有复杂的抗菌作用模式，并且具有针对啤酒糖酵母细胞的多靶点机制。

2.5 ε-PL对粉红聚端孢霉的作用机制

粉红聚端孢霉是导致几种水果和蔬菜收获后腐烂的主要病原体。Wei Meilin等[15]研究了ε-PL对粉红聚端孢霉的体外抑菌作用及其机理。结果表明，当ε-PL的浓度为100，200 μL/L时，粉红聚端孢霉的菌丝体生长和孢子萌发受到明显抑制。电导率和细胞外蛋白含量显示，ε-PL处理分别破坏了菌丝体和孢子的质膜完整性，并降低了细胞外丙二醛(MDA)和糖含量。ε-PL处理还破坏了孢子的形态，由表面光滑变得粗糙，进而收缩。ε-PL严重破坏了粉红聚端孢霉孢子的细胞壁和质膜，导致细胞质损失和液泡破裂。这些现象表明ε-PL有效地抑制了粉红聚端孢霉的生长，其机制与细胞壁和细胞膜的损伤有关。

2.6 ε-PL对指状青霉的作用机制

Liu Kewei等[16]研究了ε-聚赖氨酸对指状青霉的抑制作用及其作用机理。在这项研究中，发现ε-PL对指状青霉的抗真菌活性通过细胞膜损伤来表示。数据显示，ε-PL显著抑制了指状青霉的菌丝生长、孢子萌发率和胚管长度。此外，ε-PL还有效减少了柑橘类水果的病变直径。扫描电子显微镜显示，ε-PL处理后菌丝体形态受到严重破坏。菌丝失去了光滑度，并显示出不规则、皱缩和粗糙的表面，在较高浓度下会形成聚集和粘附。电导率测量和碘化丙啶测定表明，ε-PL处理指状青霉使质膜丧失了完整性。丙二醛是膜脂质过氧化的主要产物，当膜系统遭受压力时，它也是重要的标志之一。丙二醛的水平表明，ε-PL导致真菌病原体中脂质过氧化，且丙二醛水平与ε-PL浓度呈正相关。这些结果表明ε-PL可以作为化学农药的可持续的部分替代品。

2.7 ε-PL对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的作用机制

Li Yingqiu等[17]研究了ε-聚赖氨酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌特性及作用机制。经ε-PL处理的金黄色葡萄球菌细胞表现出不规则褶皱的外表面，具有受损细胞或细胞碎片的破碎、粘附和聚集，而且这些细胞的大小和分布不均匀，但是，没有ε-PL的细胞具有规则和球形形态，表面丰满而光滑，大小和分布均一。类似地，未经ε-PL处理的大肠杆菌细胞显示出典型的杆菌状形态，此外，表面显得饱满且有光泽。与对照相比，用ε-PL处理的大肠杆菌细胞具有不规则、干枯和粗糙的表面，形成聚集和粘附，此外，这些细胞的大小和分布不均匀。这些结果表明ε-PL处理导致对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌细胞的损害,抗菌活性随着ε-PL浓度的增加而增加。ε-PL对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径大于大肠杆菌，这表明革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌对ε-PL的敏感性高于革兰氏阴性细菌大肠杆菌。随着ε-PL浓度的增加，菌体的电导率增加，这表明细胞质膜被破坏，从而引起细胞渗漏。此外，在前45 min，ε-PL对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用非常显著。细菌细胞的泄漏可能是由于ε-PL和细胞质膜之间的相互作用引起的。金黄色葡萄球菌与对照相比，处理后的样品中31 kDa以上的条带种类和数量更多，这表明ε-PL可以通过破坏细胞蛋白来破坏细菌细胞。蛋白质条带消失的原因可能是ε-PL干扰细菌细胞蛋白质的合成，也可能是由于细胞壁和细胞膜的损伤导致其泄露，出现新的蛋白条带的原因可能是ε-PL引起细菌蛋白的聚集。

Hyldgaard等[18]也对ε-PL作用于大肠杆菌的抑菌机制进行了研究，他们测定了大肠杆菌细胞膜表面的Zeta电位，并研究了二价阳离子对抗菌活性的影响，同时通过原子力显微镜观测了ε-PL对细胞形态的影响，发现在对细胞膜进行荧光标记后，有荧光小囊泡的形成，这进一步验证了ε-PL的抑菌机理可能与抗菌肽抑菌机理中的毡毯模型类似。

3 ε-PL在食品中的应用

3.1 ε-PL在饮料中的应用

吕志良等[19]研究了ε-PL在玉米汁饮料中的防腐效果。最佳效果是在玉米汁饮料中添加30 mg/kg的ε-PL，这样在37 ℃的条件下可以至少保存30 d，使得货架期延长，且有复合稳定剂的饮料中ε-PL依旧有显著的防腐效果。经研究发现0.1%蔗糖脂肪酸酯、0.1%卡拉胶和0.2%羧甲基纤维素是最佳的复合稳定剂。吴勤等[20]对ε-PL在蓝莓汁饮料中的效果进行了研究，发现ε-PL对蓝莓汁饮料的pH、色泽、总酸含量没有显著性影响，但是对可溶性固形物含量的影响很大。ε-PL在未经过杀菌处理的蓝莓汁饮料中的最高抑菌率为79.7%，且抑菌效率一般。ε-PL对经过低温巴氏杀菌的蓝莓汁饮料进行处理，发现尚有微生物存活。综上所述，在蓝莓汁饮料中ε-PL的抑菌效果受到明显影响，可以防腐剂复配来发挥其的抑菌作用。郑柏根[21]研究了ε-聚赖氨酸盐酸盐在苏打水饮料中的作用，聚赖氨酸盐酸盐添加在苏打水饮料中可以显著抑制微生物的增长，使货架期得到延长。作为一种天然防腐剂，对苏打水的口感也没有明显的影响。徐红华等[22]研究了ε-PL在牛奶保鲜中的作用，通过双因素交互作用发现聚赖氨酸与甘氨酸复配可以使牛奶得到更好的保鲜，使其货架期得到延长。最佳配比为420 (mg/L)的PL与2%的甘氨酸，可以延长保质期至11 d。PL与其他天然抑菌剂复配，有明显的协同增效作用，可以大大提高其抑菌能力，为之后在食品中的应用奠定了基础。

3.2 ε-PL在水产及鱼糜中的应用

Cai Luyun等研究了ε-聚赖氨酸与海藻酸钠复合处理对日本鲈鱼冷藏过程中理化及微生物特性的影响。对新型ε-聚赖氨酸/海藻酸钠(PLSA)处理的日本鲈鱼在(4±1) ℃贮藏16 d的感官和理化特性的影响进行了研究，测定了鲈鱼的pH值、总挥发性碱氮、游离脂肪酸、K值、硫代巴比妥酸活性物质、色泽、质地、微生物和感官质量。研究发现，用PLSA包衣的鲈鱼保持了肉的色泽和组织硬度，并显示出较对照组低的微生物数量，包括中温菌、嗜冷菌、肠杆菌、乳酸菌和酵母菌。此外，PLSA涂层还延缓了脂质氧化、蛋白质降解和核苷酸分解的变化。结果还表明，PLSA涂膜能有效地保持鲈鱼在贮藏期间的感官品质，其效果优于单独用PL或SA处理。因此，PLSA涂层可用于鲈鱼的保鲜，以延长其货架期，提高其保鲜质量。

李唐飞等[23]研究了聚赖氨酸对冷藏鱼糜制品在保存期间的影响。鱼糜制品在保存期间容易腐败，使其品质受到影响。为了新鲜的鱼糜制品能得到很好的保存，研究了聚赖氨酸在其贮藏期间对微生物的抑制作用，以及对鱼糜制品质构、持水性、白度等方面的影响进行了研究。假单胞菌属为鱼糜制品冷藏前期的优势菌群，后期为芽孢杆菌。聚赖氨酸对它们都有抑菌作用并且添加一定浓度的聚赖氨酸能增加鱼糜的凝胶性能。

3.3 ε-PL在湿面条中的应用

李维娜等[24]研究了ε-PL在湿面条中的防腐作用。湿面条水分含量多，容易滋生细菌。研究表明，ε-PL对湿面条的抑菌效果很明显。ε-PL通过浸泡的方式对面条进行处理，最佳浓度为0.15%；当ε-PL与醋酸复配使用时最佳配比为0.1% ε-PL和0.25%醋酸，也是通过浸泡处理。ε-PL溶液浸泡熟面条比直接添加到面粉中防腐效果好且成本低，为ε-PL在面条防腐中的应用提供了依据。张春红等[25]也对ε-PL在湿面条中的防腐性能进行了研究，最大使用量为200 mg/kg。聚赖氨酸的复配防腐剂比常用的化学保鲜剂成本低、保存期长且防腐效果好。

3.4 ε-PL在肉制品中的应用

肉制品中使用最多的仍然是化学防腐剂，但天然防腐剂要更安全一些[26]。贺羽等[27]对冷却猪肉用一种或复配的保鲜剂的保鲜效果和品质的变化进行了研究。研究表明，4 ℃时用不同浓度的ε-PL处理冷却猪肉，能有效抑制细菌总数、挥发性盐基氮、pH值的升高。此外，还发现ε-PL对猪肉具有一定的护色作用，但是ε-PL对猪肉的保水能力不好，基本上没有改善，ε-PL的最佳保鲜浓度为0.24%。还研究了乙酸的防腐效果，发现乙酸减缓了细菌总数的上升，有一定的防腐作用，但在护色方面作用不明显。研究了复配保鲜剂壳聚糖和ε-PL的防腐效果，处理后的猪肉同ε-PL处理效果一样，但抑制效果更明显，在护色方面发挥了一定的作用。复配剂比单一的防腐剂防腐性能要好。浸泡处理后不但能够有效地延缓样品的细菌总数和挥发性盐基氮数值以及 pH 值的上升，最佳配比为0.24% 的ε-PL和1.8%的壳聚糖。

Li Yingqiu等[28]研究了ε-PL对储存的冷冻猪肉的物理化学特征的影响，用ε-PL处理在贮藏期间冷冻猪肉的TBC、pH值、TVB-N、高铁肌红蛋白含量显著减少(p<0.05)，并且感官评分显著提高，TBA没有改变。研究表明，1.25%的 ε-PL能有效地抑制细菌的生长和繁殖，增强对冷冻猪肉的防腐性能，因此，ε-PL对冷冻猪肉有良好的潜在的防腐和延长货架期的能力。

4 结论

ε-聚赖氨酸作为一种新型的天然抑菌剂，由链霉菌好氧发酵产生，对一些细菌和真菌的生长和繁殖有抑制作用。ε-PL会破坏它们的细胞结构，如：细胞膜、细胞壁和细胞器等，会影响细胞正常的功能代谢，造成一些物质的泄露，从而导致细胞的死亡。ε-PL对乳制品、肉制品、海产品和淀粉食品有良好的防腐效果，且制备过程简单、成本低、效果好，在将来食品防腐中占有重要地位。