舒尼替尼通过抑制Notch⁃1表达诱导人胰腺癌细胞凋亡

李淑静 张爱东 袁博 杜晓娟 罗晓冰 赵梦 王乐 杜金杰

1承德护理职业学院（河北承德067000）；2承德医学院（河北承德067000）

胰腺癌是全球常见的恶性肿瘤之一，根据美国癌症协会统计，胰腺癌位列癌症相关死亡的第4位，预计到2017年美国地区新发胰腺癌将达到53 670例，因胰腺癌死亡病例将达到43 090例［1-2］。中国国家癌症中心的统计数据表明，2015年全国男性和女性胰腺癌发病率分别为52.2/10万和37.9/10万，病死率则分别为45.6/10万和33.8/10万［3］。胰腺癌发病隐匿，较早发生远处转移及化疗不敏感及耐药性是胰腺癌病死率高的主要因素。

近些年来，多靶点抗癌药物研发已经成为新型肿瘤治疗药物研发的焦点。舒尼替尼（sunitinib、SU11248）是一种多靶点的生物靶向抗肿瘤药物，是多靶点酪氨酸激酶抑制剂，能同时抑制多条信号传导通路，具有抗肿瘤和抗血管生成作用［4］。舒尼替尼在肾细胞癌和胃肠间质瘤的临床前和临床研究中均显示出了确切的抗肿瘤效应［5-6］。已有研究发现舒尼替尼在神经内分泌肿瘤、乳腺癌等其他实体肿瘤中显示出明显的抗肿瘤效应［7-9］。然而在胰腺癌治疗中的作用报道较少。

在本研究中，我们首先发现一定浓度的舒尼替尼对胰腺癌细胞具有一定的抑制增殖作用，同时我们发现Notch信号通路在舒尼替尼诱导人胰腺癌细胞凋亡中的具有调节作用。Notch信号通路在维持细胞的自我更新、生长、分化等过程中发挥着重要作用，其在调控细胞的凋亡及肿瘤化疗耐药性中亦起着极为重要的作用。本研究将为开发新型胰腺癌治疗药物提供新思路和理论指导。

1 材料与方法

1.1 药物 舒尼替尼购自ChemicalBook（CB972 8174），溶于二甲基亚砜（DMSO，Solarbio生物技术有限公司），起始浓度为100 μmol/L，用细胞培养液进行稀释。

重组表达质粒pcDNA3.0⁃Flag⁃NICD由上海吉玛生物制品公司合成；兔抗人Notch1抗体（C⁃20，SC⁃6014）购自 Santa Cruz公司；兔抗人 Caspase⁃3，Caspase⁃8，Caspase⁃9抗体，HRP标记山羊抗兔二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 细胞培养与稳定转染 人胰腺癌细胞系Mia⁃Paca⁃2、Capan⁃1 购自美国模式菌种收集中心（ATCC），培养于含有10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、1 μg/mL 链霉素的 1640（Gibco）培养基中。置于含有5%CO2和95%空气的37℃恒温培养箱。在25 cm2的培养瓶中培养至细胞汇合度达到约80%～90%，0.25%胰蛋白酶进行消化传代。取对数生长期的细胞来进行实验。

Capan⁃1细胞稳定转染：根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，优化体系后进行转染。转染前将细胞接种至塑料平皿中，控制细胞数量，使对数生长期细胞生长到所需密度（80%～90%）时转染适量表达质粒DNA。用一定量的双无培养基（无血清、无抗生素的1640细胞培养液）稀释DNA，轻轻震荡混匀，静置5 min。按1∶2的比例将Lipofectamine 2000用双无1640细胞培养液稀释，轻轻震荡混匀，静置5 min。将稀释的Lipo⁃fectamine 2000加到稀释的DNA液中轻轻震荡混匀，静置20 min。用PBS洗涤细胞，给细胞培养皿中的细胞换上4 mL双无1640培养基。将DNA和Lipofectamine 2000的混合液加入细胞中，继续在37℃、5%CO2恒温培养箱中培养4～6 h后，换完全培养基继续培养24～48 h。将培养液换成含不同浓度G418抗生素的培养基，抗生素浓度按梯度递增（0、50、100、200、400、600、800和1 000 μg/mL）。持续培养10～14 d以800 μg/mL浓度进行维持培养筛选稳定表达克隆，进行后续实验。

1.3 MTT法检测舒尼替尼对Mia⁃Paca⁃2、Capan⁃1细胞的增殖抑制作用 消化、收集1×104对数生长期细胞，每孔取100 μL接种于96孔板培养24 h，加入舒尼替尼终浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μmol/L 的 1640 培养基 150 μL/孔，对照孔只加入等量的培养基即可，每个浓度设3个复孔，分别作用24、48、72 h，整体实验重复3次。加入20 μL MTT（5 mg/mL，Sigma）在37 ℃恒温培养箱继续孵育4 h后，扣掉上清液，加入150 μL DMSO，在摇床上缓慢震荡直至蓝色结晶充分溶解。利用全自动酶标仪检测细胞在490 nm波长的吸光度（OD值）。公式：细胞增殖抑制率（%）=［1-（实验组/对照组）］×100%。计算50%细胞生长抑制所需的药物浓度（IC50）及不同浓度的舒尼替尼对细胞增殖的抑制效应。数据统计采用均值±标准差（n=5）表示。以药物浓度对数值为X轴，OD值为Y轴作图，从图中求出半数抑制浓度（IC50）。

舒尼替尼对稳定转染pcDNA3.0⁃Flag⁃NICD细胞增殖的影响检测方法同上。

1.4 细胞核染色法检测细胞形态学变化 取对数生长期Capan⁃1细胞，经0.25%胰酶消化重悬后，以1×107个/L密度接种于预置盖玻片的6孔板中，细胞贴壁后吸弃旧培养液，加入终浓度为1.0、0.5、0.25 μmol/L的舒尼替尼2 mL作用48 h后，吸弃培养液，PBS洗涤细胞3次，加入2 mL 4%多聚甲醛4℃固定15 min；PBS洗涤，5 min×3次，缓摇，加5 μg/mL DAPI避光染色2 min，避光条件下PBS洗涤，5 min×3次，荧光显微镜下观察细胞形态变化，实验重复3次。

舒尼替尼对稳定转染pcDNA3.0⁃Flag⁃NICD细胞凋亡的影响检测方法同上。

1.5 蛋白质免疫印迹分析（Western Blot） 不同浓度舒尼替尼药物作用细胞48 h，预冷PBS洗涤两次，加入1×细胞裂解缓冲液（RIPA）100 μL，冰浴裂解细胞30 min，每10 min震荡混匀一次，12 000 r/min、离心5 min，加入等体积的上样缓冲液，100℃水浴5 min，储存于-20℃冰箱。SDS⁃PAGE电泳后，湿转法转移凝胶中蛋白至PVDF膜上。5%脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗膜，加入兔抗人一抗（封闭液1∶200稀释）4℃孵育过夜。TBST洗膜三次，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗（按1∶5 000稀释）室温孵育1 h。等体积加入化学发光液（A、B液）进行显影，BioRad凝胶成像系统分析检测，图像经Image J软件分析测定蛋白丰度。

舒尼替尼对稳定转染pcDNA3.0⁃Flag⁃NICD细胞凋亡信号相关蛋白表达的影响检测方法同上。1.6 统计学方法 所有数据采用均值±标准差（n=3～6）表示。两组之间进行比较采用双侧t检验进行，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度舒尼替尼对胰腺癌细胞增殖具有显著的抑制作用 终浓度为 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μmol/L 舒尼替尼作用细胞 24、48、72 h后，MTT法检测细胞增殖情况。结果发现舒尼替尼对 Mia⁃Paca⁃2、Capan⁃1 细胞生长具有增殖抑制作用，抑制效果呈时间、浓度依赖性，与对照组进行比较，不同时间和不同浓度舒尼替尼增殖抑制率差异均有统计学意义（P＜0.05）。

当细胞稳定转染pcDNA3.0⁃Flag⁃NICD，过表达Notch 1胞内段，细胞增殖能力显著提高，加入舒尼替尼不能有效抑制细胞增殖。见图1。

2.2 不同浓度舒尼替尼诱导Capan⁃1细胞发生凋亡形态改变 终浓度为0.25、0.5、1.0 μmol/L舒尼替尼作用细胞株Capan⁃1 48 h后，同对照组相比，实验组随着药物浓度的增加凋亡细胞明显增多，细胞出现核固缩、体积缩小或核碎裂的现象，出现较深的蓝色荧光。且随着药物浓度的增加，处于凋亡晚期细胞明显增多（图2、3）。实验结果表明，舒尼替尼抑制细胞增殖可直接通过诱导细胞凋亡实现。同样浓度舒尼替尼作用稳定表达pcD⁃NA3.0⁃Flag⁃NICD细胞时，细胞凋亡显著降低（P＜0.05）。

图2 舒尼替尼诱导胰腺癌细胞凋亡形态学改变Fig.2 Morphological changes of the apoptosic pancreatic cancer cells induced by Sunitinib

图3 舒尼替尼诱导胰腺癌细胞Capan⁃1凋亡统计Fig.3 Calculation of capan⁃1 cell apoptosis induced by Sunitinib

2.3 舒尼替尼对Capan⁃1细胞凋亡信号通路及Notch⁃1表达的影响 0.25、0.5、1.0 μmol/L舒尼替尼作用Capan⁃1细胞48 h后，Notch⁃1蛋白的表达量随药物浓度的增加而降低（P＜0.05），同对照组相比，各浓度组舒尼替尼均能降低Notch⁃1蛋白的表达水平（P＜0.05）。同时，经过舒尼替尼处理后，Capan⁃1 细胞凋亡相关蛋白 Caspase⁃9、Caspase⁃8、Caspase⁃3随药物浓度的增加表达水平明显增加，表明了这些凋亡相关蛋白参与了细胞凋亡的过程（图4），实验组与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。然而，舒尼替尼不能诱导过表达NICD细胞凋亡相关通路蛋白表达水平增高。

图4 舒尼替尼对胰腺癌细胞凋亡信号通路相关蛋白表达的影响Fig.4 Effect of Sunitinib on the expressions of apoptosic signaling pathway in pancreatic cancer cells

3 讨论

胰腺癌被称之为“癌中之王”，是目前预后非常差的肿瘤之一。具有起病隐匿、早期诊断困难、转移早、化疗耐受、临床治疗效果差、病死率高等特点，其1年生存率＜ 20%，5年生存率不足5%［10］。因此，寻找胰腺癌早期诊断分子标记物，开发新型、高效、副作用小、靶向性强新药迫在眉睫。近年来，随着新药研发和药物临床试验的开展，为晚期胰腺癌的治疗带来了新希望。舒尼替尼是一种口服的小分子多靶点酪氨酸酶抑制剂，已被用于治疗肾癌和对伊马替尼抵抗的胃肠道间质瘤，临床前研究发现舒尼替尼能够明显抑制非小细胞肺癌移植瘤模型，并且临床研究均显示在乳腺癌、神经内分泌肿瘤、非小细胞肺癌等肿瘤中也具有明显的抗肿瘤效应。

在本研究中，我们首先检测舒尼替尼是否对胰腺癌细胞增殖具有抑制作用。MTT结果表明，不同浓度舒尼替尼对两种胰腺癌细胞均有显著的增殖抑制作用，而且抑制作用具有浓度和时间依赖性。但是其抑制作用的分子机制不清楚。有研究表明，Notch信号通路激活能抑制顺铂诱导的肿瘤细胞的凋亡［11］，同时，Notch通路在胰腺癌组织及细胞中表达增高、活性增强，提示说明Notch通路可能在胰腺癌化疗耐受中发挥一定的作用。马永超等［12］研究表明Notch通路蛋白表达及活性受到酪氨酸激酶的调节，作为酪氨酸激酶抑制剂的舒尼替尼是否能通过抑制Notch通路的蛋白表达及活性，发挥抑制胰腺癌细胞增殖及诱导凋亡的作用，需要进行深入研究。蛋白质免疫印迹实验结果表明，不同浓度舒尼替尼作用胰腺癌细胞48 h，Notch1蛋白表达水平显著下降；同时，调节细胞凋亡的相关蛋白表达水平显著增高，说明Notch1通路可能参与舒尼替尼诱导的胰腺癌细胞凋亡的发生。当胰腺癌细胞稳定过表达NICD后，不同浓度舒尼替尼不能显著抑制细胞的增殖和诱导凋亡，进一步验证了我们的假设。该研究将为有效提高胰腺癌化疗敏感性、减少化疗耐受，改善胰腺癌患者预后提供积极的理论依据。