甘草酸二铵对百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌TGF⁃β1的影响

向沥 方辰 周志兵 张剑锋

广西医科大学第二附属医院全科医学教研室（南宁530007）

前期研究已经证实，转化生长因子（TGF⁃β1）在百草枯导致的急性肺损伤和肺纤维化中起到关键作用，但其作用机制尚不明确。Ⅱ型肺泡上皮细胞（AECⅡ）是百草枯致肺损伤的主要靶细胞［1］，AECⅡ在此过程中出现细胞凋亡、线粒体破坏等表现［2］。AECⅡ也是TGF⁃β1分泌的重要来源［3］。我们同期动物实验已经发现，药物甘草酸二铵对急性肺损伤具有保护作用，并能抑制急性肺损伤时TGF⁃β1的过度表达［4］，并因此推测：甘草酸二铵对百草枯中毒时Ⅱ型肺泡上皮细胞具有保护作用。但甘草酸二铵抑制肺损伤时TGF⁃β1表达是否与AECⅡ相关仍未有报道。本实验将通过体外培养大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，构建甘草酸二铵干预百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤模型，进一步观察甘草酸二铵对百草枯刺激大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞分泌TGF⁃β1的影响，以期了解其具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂 大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（上海沪震实业公司），RPMI Medium 1640培养液、胎牛血清（美国Gibco公司），米非司酮、MTT试剂（美国Sigma公司），青链霉素混合液（100×）（北京索莱宝科技有限公司），百草枯（美国Sigma公司），甘草酸二铵（江苏正大天晴制药有限公司），总RNA抽取试剂盒、逆转录试剂盒（美国Roche公司），大鼠TGF⁃β1 ELISA试剂盒（武汉华美生物工程有限公司），荧光定量PCR仪（美国Applied Bio⁃systems StepOne公司），酶标仪（美国BioTek Instru⁃ments公司）。

1.2 细胞培养及分组 按PQ浓度将AECⅡ分为不同浓度的培养组：200、400、600、800、1 000、1 500、2 000 μmol/L组，了解IC50的PQ浓度。确立以1 000 μmol/L PQ刺激AECⅡ，再重新于96孔板中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0 mg/mL DG培养2 h，再以对应浓度的DG+1 000 μmol/L PQ培养24 h。了解干预PQ刺激下AECⅡ生存率最高的DG浓度。最后进行DG干预PQ刺激AECⅡ分泌TGF⁃β1实验，将细胞分为3组：空白对照组，未干预培养24 h；PQ 组，以含1 000 μmol/L PQ的培养基培养24 h；DG组，先以含0.6 mg/mL DG的培养基培养2 h，再以0.6 mg/mL DG+1 000 μmol/L PQ的培养基培养24 h。

1.3 检测指标和方法

1.3.1 不同PQ浓度组和不同DG浓度组细胞的存活率 采用MTT比色法。用多功能荧光发光仪检测波长570 nm处的吸光度（A）值，计算存活率。存活率（%）=实验组A值/对照组A值×100%。

1.3.2 AECⅡ倒置显微镜下观察 培养24 h后使用倒置显微镜观察细胞的形态改变、生长情况。

1.3.3 TGF⁃β1浓度测定 取细胞培养物上清，用ELISA试剂盒按说明书检测TGF⁃β1的浓度。

1.3.4 TGF⁃β1 mRNA水平测定 用TriPure法提取大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞总RNA，以逆转录试剂盒逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行RT⁃PCR。以β⁃actin作为内参照，每组设3个复孔。β⁃actin上游引物序列 5′⁃CTATCGGCAATGAGCGGTTCC⁃3′，下游引物 5′⁃TGTGTTGGCATAGAGGTCTTTACG⁃3；TGF⁃β1上游引物序列5′⁃CATTGCTGTCCCGTG⁃CAGA ⁃3′，下 游 引 物 序 5′⁃AGGTAACGCCAG⁃GAATTGT⁃TGCTA⁃3′。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸60 s，扩增40个循环。PCR后，用ABI 7500软件分析基因扩增情况，得到相应Ct值，基因相对表达量采用2⁃△△Ct方法计算。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0软件对数据进行统计学处理。正态分布计量资料以均数±标准差表示，多组数据比较采用单因素方差分析，组间相互比较采用LSD⁃t检验作两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PQ对AECⅡ增殖作用的影响 在含浓度为200、400、600、800、1 000、1 500 和2 000 μmol/L的PQ培养液中培养24 h后，随着PQ浓度增加而生存率降低。IC50的PQ浓度为920.87 μmol/L，因此在本次实验中，以1 000 μmol/L PQ作为诱导浓度。见图1。

图1 不同PQ浓度对细胞存活率的影响Fig.1 The of viability of AECⅡcultured with varied concentrations of PQ

2.2 DG对PQ刺激下AECⅡ增殖作用的影响在1 000 μmol/L PQ刺激下，以0 、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0浓度DG干预AECⅡ，以0.6 mg/mL DG干预24 h生存率最高。因此，在本次实验中，以0.6 mg/mL DG作为干预浓度。见图2。

2.3 细胞倒置显微镜下观察 NS组（图3A）细胞排列紧密、贴壁良好。与NS组比较，PQ组（图3B）中细胞稀疏，细胞膜出现皱缩，细胞形态不规则。而且细胞贴壁不良，有脱落凋亡。DG组（图3C）中细胞亦出现形态不规则，细胞贴壁不良，脱落凋亡，但与PQ组比较细胞损伤明显减轻。

2.4 AECⅡ培养物上清TGF⁃β1的变化 与对照组比较，PQ组TGF⁃β1蛋白浓度明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PQ组比较，DG组TGF-β1浓度明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。与对照组比较，PQ组TGF⁃β1 mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与PQ组比较，DG组TGF⁃β1 mRNA表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图2 甘草酸二铵对百草枯（1 000 μmol/L）刺激下大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖作用的影响Fig.2 Effects of DG on the proliferation of AECⅡstimulated by paraquat（1 000 μmol/L）

3 讨论

图3 细胞倒置显微镜下观察（20×）Fig.3 Observation of cell morphology by inverted microscope

图4 各组细胞TGF⁃β1蛋白表达（n=3）Fig.4 The levels of TGF⁃β1 in cell culture supernatant

图5 各组细胞的TGF⁃β1 mRNA表达（n=3）Fig.5 The expressions of TGF⁃β1 mRNA in cell culture supernatant

百草枯中毒对人体各个器官组织都有损伤，以肺组织的损伤最为严重。百草枯中毒机制可能与形成大量氧自由基使生物膜中的多不饱和脂肪酸发生过氧化，造成DNA损伤；以及激活免疫细胞、炎症细胞释放大量的细胞因子、趋化因子、早期生长因子等多种生物学效应，造成组织炎症反应及肺纤维化［5］。百草枯对肺的作用可能与Ⅱ型肺泡上皮细胞存在聚胺类转运系统有关［1］，故PQ进入人体后在肺组织中大量聚集。PQ中毒18 h后，AECⅡ开始出现水肿，24 h后，AECⅡ中的线粒体明显水肿、破裂［6］，72～ 96 h后，肺泡上皮细胞出现坏死［7］。因此，AECⅡ损伤是百草枯性肺损伤的关键启动环节，Ⅱ型肺泡上皮细胞的进一步损伤导致的肺脏自身修复功能障碍可能是导致急性百草枯中毒肺损伤进入不可逆的阶段的重要原因。逆转AECⅡ的细胞功能，将对治疗百草枯性肺损伤具有极其重要的意义。甘草酸二铵在化学结构上与肾上腺皮质激素具有相似性，也具有与糖皮质激素和盐皮质激素类似的功能作用。甘草酸可影响糖皮质激素受体和盐皮质激素受体，从而影响机体类固醇效应。具有广泛的抗炎、抗氧化、抗病毒、调节免疫、护肝及抗肿瘤等功能，甘草酸亦可减轻肺部炎症反应。因此，DG在PQ诱导ALI的治疗方面有着巨大潜力。但DG调控肺部炎症损伤的具体机制尚未明确。

本实验在构建甘草酸二铵干预百草枯损伤大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞模型中，进行MTT实验发现，在一定范围内，随着PQ浓度的升高，AECⅡ的损伤增强。IC50的PQ浓度为920.87 μmol/L。因此，在本次细胞实验中，以1 000 μmol/L作为诱导浓度。在1 000 μmol/L PQ诱导下，以0.6 mg/mL DG干预AECⅡ24 h生存率最高，以0.6 mg/mL DG作为干预浓度。体外细胞实验结果显示，AECⅡ在含PQ的培养基培养24 h后，TGF⁃β1分泌水平明显升高。同时甘草酸二铵减少PQ诱导下AECⅡ中TGF⁃β1的分泌水平，证实甘草酸二铵可直接影响AECⅡ的TGF⁃β1表达。

TGF⁃β1可促使肺成纤维细胞过度增殖、分化，诱导胶原蛋白等细胞外基质在肺内过度积聚［8］，启动肺纤维化的发生与发展，在肺纤维化的形成过程中发挥重要作用。在PQ中毒的肺组织中，随着TGF⁃β1的过度表达，肺间质纤维化程度也不断加深，同时PQ还能刺激成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，最终造成不可逆的肺功能衰竭［9］。TGF⁃β还与其他参与肺纤维化形成的细胞因子之间有着紧密联系。TGF⁃β1可诱导结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的过度表达，而CTGF在细胞外基质沉积过程中起着关键作用［9-10］。有研究表明，PQ中毒能够使MRC⁃5细胞TGF⁃β1/Smad信号通路活化，调节下游基因CTGF的表达，继而介导TGF⁃β1的促纤维化作用［11］。

甘草酸二铵通过抑制AECⅡ中TGF⁃β1的过度表达可能有如下途径：（1）通过减轻百草枯致AECⅡ损伤时ROS的过度产生，而进一步减少TGF⁃β1的过度表达；百草枯致肺损伤时，所产生的ROS可刺激前纤维化因子TGF⁃β1的产生［12］。有研究表明，乌司他丁可减轻百草枯致AECⅡ损伤中ROS的过度产生［13］，甘草酸二铵也有可能通过该途径减轻TGF⁃β1的过度表达。（2）通过抑制百草枯致AECⅡ损伤时NF⁃κB的过度表达，从而降低AECⅡ中TGF⁃β1的过度分泌。在百草枯导致肺纤维化的过程中，NF⁃κB的活化可引起下游目标基因TGF⁃β1转录的激活［14］，有研究发现，甘草酸可以选择性抑制Ca2+通道活性而抑制NF⁃κB对其靶元件的结合活性，降低NF⁃κB的表达［15］，以此减轻TGF⁃β1的过度表达。（3）通过上调糖皮质激素受体（GR）的表达，促进糖皮质激素作用，进而降低百草枯致AECⅡ中TGF⁃β1的表达。课题前期实验有证明，甘草酸二铵可上调大鼠急性肺损伤的GR表达水平［16］。DG通过上调GR间接影响TGF⁃β1的表达水平。

综上所述，本文通过细胞培养体外研究观察了DG干预对AECⅡ的损伤和分泌TGF⁃β1功能的影响，在百草枯致肺损伤早期，AECⅡ分泌的前纤维化因子TGF⁃β1参与了肺损伤及肺纤维化的病程；甘草酸二铵能通过抑制AECⅡ的TGF⁃β1过度表达，从而减轻肺组织的损伤，但其具体作用机制尚需进一步研究。体外研究的局限性在于未能综合考虑各细胞和组织间的综合作用，还需更多实验进一步研究甘草酸二铵对百草枯致急性肺损伤中肺内巨噬细胞、中性粒细胞等和各炎症因子及其相关信号通路的作用。