香烟烟雾暴露诱导小鼠血管平滑肌细胞凋亡的机制

廖思聪 王大新

1中南大学湘雅二医院心内科（长沙 410011）；2江苏省苏北人民医院心内科（江苏扬州 225001）

血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）是血管组织中最主要的细胞类型，在生理状态可维持低水平的死亡和增殖功能，然而在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）发生发展过程中，VSMC的凋亡水平异常增高，提示VSMC的功能变化在AS等慢性炎症疾病中具有重要地位［1］。近年来研究发现，在人AS斑块中VSMC是泡沫细胞的主要细胞来源之一，VSMC源性泡沫细胞在AS病程进展中，发生凋亡或坏死将可能是引起斑块不稳定甚至破裂的重要因素［2-3］。吸烟是心血管疾病公认的独立危险因素，香烟烟雾暴露可引起血管内皮的功能障碍，并引起慢性炎症状态［4-5］，但因香烟烟雾中成分复杂，其致病机制目前尚无定论。AS的发生发展过程相当复杂，AS形成机制目前尚不完全清楚，因此，研究VSMC凋亡的诱发机制可能对防治AS具有重要的理论和临床意义［6-7］。本研究以香烟烟雾提取物体外干预小鼠VSMC为切入点，探讨香烟烟雾暴露对血管平滑肌细胞凋亡的影响及可能的机制，为抗AS研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 Bax抗体和GRP78抗体购自美国Santa公司；Bcl⁃2抗体和Chop抗体购自美国CST公司；β⁃actin抗体购自美国Sigma公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；PVDF膜购自美国Merck公司；ECL显影液购自美国Thermo公司。胎牛血清购自浙江天杭生物公司；红金龙香烟为中烟工业公司产品；山羊抗兔二抗和小鼠二抗为北京中杉金桥公司产品；青链霉素双抗溶液、RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量试剂盒为北京索莱宝公司产品；Annexin V⁃FITC/PI凋亡检测试剂盒为北京康为世纪公司产品；RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒以及PCR扩增试剂盒均为北京天根科技公司产品。Tecan M2000酶标仪为美国Tecan公司产品；BD FACSCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品；ChemiDoc XRS化学发光成像仪为美国Bio⁃Rad公司产品；Step One Plus实时荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。

1.2 细胞培养与实验分组 小鼠主动脉血管平滑肌细胞株VSMC由南京医科大学病理生理学系惠赠，使用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基常规培养于37℃、5%CO2细胞培养箱。用0.25%胰酶消化传代，只取10代以内的对数期细胞进行实验。实验分组：对照组采用无血清培养基培养，CSE低浓度组、中浓度组和高浓度组则分别加入终浓度为1%、5%和10%的CSE，细胞培养12 h后行相关实验检测。

1.3 香烟烟雾提取物的制备 参考LEE等［8］报道的方法制作负压抽吸装置，制备本实验所需的香烟提取物（cigarette smoke extract，CSE）。1支点燃的香烟（焦油含量10 mg/支，尼古丁含量0.9 mg/支），使用50 mL针筒通过负压吸引装置将香烟烟雾连续抽吸入盛有20 mL PBS的密闭烧瓶内，持续抽吸3～5 min直至香烟燃尽。抽吸完毕后溶液经0.22 μm孔径滤器过滤以除去细菌和大分子颗粒，即得到浓度为100%的CSE原液。实验所需的不同浓度CSE溶液用相应体积的无血清培养基稀释，配制好不同浓度的CSE须在30 min内用于实验。

1.4 CCK⁃8法检测细胞增殖 取对数生长期细胞接种于96孔板，对照组细胞使用无血清培养基培养，各CSE处理组分别给予不同浓度CSE（1%、5%和10%）的无血清培养基处理，同时设不接种细胞只含培养基的空白组，每组3个复孔，12 h后加入10 μL CCK⁃8溶液继续培养2 h，随后经酶标仪检测各样本在450 nm处的OD值。细胞存活率=（OD处组-OD空白组）/（OD对照组-OD空白组）×100%。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡率 参照凋亡试剂盒操作，消化收集细胞后，调整细胞密度约为5×105个/mL，离心（4 ℃，1 000 r/min）5 min，预冷 PBS漂洗细胞2次，弃上清，细胞重悬于100 μL结合缓冲液，随后加入5 μL Annexin V⁃FITC 和10 μL碘化丙碇（PI），室温避光反应15 min，再加入 400 μL PBS，30 min内上机检测细胞凋亡率。Annexin V⁃FITC阳性细胞为早期凋亡细胞，PI阳性细胞为晚期凋亡或坏死细胞，而Annexin V⁃FITC/PI双阴性细胞为正常活细胞，故Annexin V⁃FITC单阳性细胞群占总细胞群的百分比即为本实验检测的细胞凋亡率。

1.6 实时定量PCR检测mRNA表达 采用Primer Premier 5.0软件设计各基因的引物序列，由上海生工生物公司负责合成。各引物序列如下：Bcl⁃2正链5′⁃CCAGGACGTCTCCTCTCAGG⁃3′，反链 5′⁃AA⁃GATGGTGATGGGCTTCCCG⁃3′；Bax正链 5′⁃CGT⁃GAGCG GCTGCTTGTCTG⁃3′，反链 5′⁃TGGTGAGC⁃GAGGCGGTGAG⁃3′；Grp78正链 5′⁃GCGTCGGTGT⁃GTTCAAGAAC⁃3′，反链5′⁃AAGGGTCATTCCAAGT⁃GCGT⁃3′；Chop 正链5′⁃CCAACAGAGG⁃TCACACG⁃CACATC⁃3′，反链 5′⁃TCGTTCTCCTGCTCCTTCTCC⁃TTC⁃3′；Gapdh正链5′⁃TGGCAAAGTGGAGATTGTT⁃GCC⁃3′，反链 5′⁃AAGATGGTGATGGGCTTCCCG⁃3′。参照总RNA提取试剂盒的操作说明提取细胞RNA，经反转录试剂盒合成cDNA，随后加入SYBR Green试剂经荧光定量PCR仪检测分析，最后通过扩增曲线、溶解曲线以及各样本的CT值确认扩增反应。本实验以GAPDH作为内参基因，利用2-ΔΔCt法计算各样本的mRNA相对表达。

1.7 Western blot检测蛋白表达 参照RIPA蛋白裂解液说明书提取细胞总蛋白，每孔加入200 μL含1%蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上裂解10 min后，4℃，12 000g离心10 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量试剂盒检测各样本的蛋白浓度。将蛋白样本与5 X蛋白上样缓冲液混匀，煮沸10 min后暂存于-20℃冰箱。每孔总蛋白上样量为30 μg，使用10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至PVDF膜后，5%脱脂奶粉封闭2 h。分别用Bcl⁃2抗体（1∶1 000）、Bax抗体（1∶1 000）、GRP78抗体（1∶1 000）、CHOP抗体（1∶1 000）和β⁃actin抗体（1∶3 000）4℃孵育过夜，对应的HRP标记二抗（小鼠二抗1∶4 000，兔二抗 1∶3 000）室温孵育1 h，PBST溶液洗膜3次后，经ChemiDoc XRS化学发光成像分析系统分析各条带灰度值。本实验以β⁃actin作为内参，各目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值则为蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法 实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析（one⁃way ANOVA），组间均数比较用Dunnett法，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 香烟烟雾暴露抑制VSMC增殖 为检测香烟香雾暴露对VSMC细胞增殖的影响，本研究设置1%、5%和10%不同浓度的CSE处理组，以CCK⁃8法检测VSMC细胞存活率。结果显示（图1），对照组、1%CSE处理组、5%CSE处理组和10%CSE处理组细胞存活率分别为（100±2.16）%、（97.66± 1.57）%、（91.18± 4.86）%和（85.37± 2.75）%。其中，1%CSE处理组相比对照组细胞增殖有降低的趋势，但差异无统计学意义（P=0.17），而5%CSE处理组和10%CSE处理组细胞增殖较对照组降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果提示，香烟烟雾暴露可抑制VSMC细胞增殖，同时也为后续探索细胞凋亡等实验条件提供依据。

图1 CSE对VSMC细胞增殖的影响Fig.1 The effect of CSE on the proliferation of VSMC cells

2.2 香烟烟雾暴露诱导VSMC细胞凋亡 为探讨香烟烟雾暴露对VSMC凋亡的影响，结合此前细胞增殖的实验结果，本研究以1%、5%和10%不同浓度CSE干预细胞12 h后，通过Annexin V⁃FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示，细胞凋亡率相比对照组（5.84±1.21）%，1%CSE处理组（14.20±1.53）%、5%CSE处理组（24.18±2.44）%和10%CSE处理组（30.64±2.52）%呈浓度依赖性显著增高（图2），差异具有统计学意义（P＜0.01）。凋亡相关蛋白和mRNA的检测结果显示，1%CSE处理组、5%CSE处理组和10%CSE处理组中抗凋亡效应的Bcl⁃2蛋白和mRNA水平，相比对照组表达呈浓度依赖性下调，而促凋亡作用Bax的蛋白和mRNA表达则浓度依赖性上调（图3），差异具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果表明，香烟烟雾暴露对VSMC细胞凋亡具有明显的促进作用。

2.3 香烟烟雾暴露激活ERS信号途径 本研究推测香烟烟雾暴露诱导VSMC凋亡可能与激活内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途径有关，因此进一步检测了2个ERS标志分子GRP78以及Chop的蛋白和mRNA表达。结果显示相比对照组，1%CSE处理组、5%CSE处理组和10%CSE处理组GRP78和Chop的蛋白与mRNA表达呈浓度依赖性增加（图4），差异具有统计学意义（P＜0.05）。上述结果表明，香烟烟雾暴露可激活VSMC细胞的ERS信号。

图2 CSE对VSMC细胞凋亡的影响Fig.2 The effect of CSE on the apoptosis of VSMC cells

图3 CSE对VSMC细胞凋亡相关蛋白和mRNA表达的影响Fig.3 Effects of CSE on the expression of apoptosis related protein and mRNA in VSMC cells

图4 CSE激活VSMC细胞内质网应激信号Fig.4 CSE activates the endoplasmic reticulum stress signal of VSMC cells

3 讨论

VSMC是血管组织中合成胶原纤维的主要细胞，可维持AS斑块的结构稳定，一旦VSMC细胞死亡将导致斑块中胶原成分减少，这也是后续斑块不稳定甚至破裂的重要原因之一［1，9］。DICKHOUT等［10］在人体冠心病组织中证实与稳定型斑块相比，倾向于破裂的薄壁型斑块以及破裂的斑块内凋亡细胞异常增加，包括GRP78和Chop等ERS标志信号表达增高，并发现这些斑块组织中凋亡细胞和高表达的ERS相关蛋白主要来源于VSMC。随着AS疾病进展，斑块中巨噬细胞的吞噬能力会逐渐减弱，将难以吞噬清除凋亡的VSMC，一旦这些残余的凋亡细胞发展为坏死细胞，并释放白介素（interleukin，IL）IL⁃1α、IL⁃6和单核趋化蛋白1（monocyte chemotactic protein）等炎症因子，将导致慢性炎症状态，加剧AS的发生发展［6，11-12］。总之，以VSMC凋亡为靶标逐渐成为AS的研究热点［13-14］，对防治心血管疾病具有重大意义。

吸烟是心血管疾病公认的独立危险因素，同时也是肺部疾病重要的致病因素［15］。LEE等［8］研究证实香烟暴露可促进小鼠肺成纤维细胞合成IL⁃6、TNF⁃α以及活性氧族（reactive oxygen species）等促炎因子，引起炎症反应以及氧化应激。香烟烟雾的成分复杂多变，含有多种有毒有害物质，不仅对呼吸系统具有直接的细胞毒害作用，香烟中有害物质溶于血液后可能对心血管系统也有长期潜在的致病作用［16］。本研究表明，CSE体外干预VSMC后细胞凋亡率明显增加，而Bcl⁃2的蛋白和mRNA表达下调，Bax的蛋白和mRNA表达上调，推测香烟烟雾暴露可诱导VSMC凋亡。凋亡是在各种生理或病理状态下细胞的一种程序性死亡方式，凋亡过程受到促凋亡和抗凋亡的双重调控，其中BCL⁃2家族在平衡凋亡过程中具有重要作用。基于结构和序列的同源性，BCL⁃2家族中抗凋亡蛋白包括 Bcl⁃2、Bcl⁃xl以及 MCL⁃1 等，而 Bax、Bak 和Bim等蛋白则具有促凋亡效应［17］。例如，Bax可介导细胞色素C（cytochrome C）自线粒体释放至胞质中，进而通过经典的线粒体途径促发细胞凋亡［18］。

ERS是在各种原因激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）后细胞做出的适应性反应，在AS中发挥关键性作用［19］。早期轻度的ERS通过诱导糖调节蛋白（glucose regulated pro⁃tein 78 kD，GRP78）等内质网分子伴侣表达增加，以减轻UPR从而产生保护效应，而持续或强烈的ERS可通过Chop、caspase⁃12以及JNK等信号通路诱导细胞凋亡。Chop蛋白作为ERS信号分子，同时也是激活细胞色素C极其重要的诱导因子。细胞色素C自线粒体释放至胞质引起的线粒体膜电位变化，可直接促发细胞凋亡［20-22］。因此GRP78和Chop可在一定程度反映ERS强烈程度，是细胞发生ERS的标志信号。本研究结果显示，CSE可浓度依赖性增加VSMC细胞中GRP78以及Chop的蛋白和mRNA表达，因此推测香烟烟雾暴露诱导VSMC凋亡可能与ERS信号途径有关。任妮娜等［23］报道PM2.5暴露可致肺癌细胞发生自噬，提示本研究中香烟烟雾暴露诱导VSMC凋亡部分与ERS有关外，可能也有细胞自噬的参与，有待进一步研究证实。

总之，本研究通过CSE体外干预小鼠VSMC较好地模拟吸烟可能引起的细胞损伤，首次从ERS途径探讨了香烟烟雾暴露诱导VSMC凋亡的分子机制。本研究的局限性在于只涉及体外实验，今后还需进一步开展动物实验。综上所述，香烟烟雾暴露可能通过ERS途径诱导体外VSMC凋亡。抑制香烟烟雾暴露诱导的VSMC凋亡可能是今后抗AS新的研究思路。