葡萄糖对滋养细胞内脂素表达的影响

张艳红 尹晓茜 霍琰 王润芳 邢邯英 刘素新

河北省人民医院1产科，3临研中心（石家庄 050051）；2河北北方学院研究生院（河北张家口 075000）

内脂素（visfatin）是一种主要由胎盘和内脏脂肪组织表达和分泌的脂肪细胞因子，可参与炎症反应的调节，参与糖脂代谢，还与胰岛素抵抗（IR）和妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）发病密切相关。然而GDM患者visfatin水平升高或降低，及visfatin在GDM发病机制中的作用仍存在争议。

过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR⁃γ）是一种细胞核受体，国外一项研究表明，在人巨噬细胞中PPAR⁃γ参与诱导visfatin基因表达［1］，而在滋养细胞PPAR⁃γ是否参与visfatin表达的调节，国内外未见研究和报道。c⁃Jun氨基末端激酶（JNK）属于丝/苏氨酸蛋白激酶，能够被多种细胞因子和应激激活，如：紫外线照射、内质网应激、氧化应激、炎症因子等，被认为是联系炎症和IR的重要信号转导分子［2］。本研究以葡萄糖作用于人滋养细胞（BeWo）观察visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK表达的变化，探讨葡萄糖对visfatin表达的调节及是否通过PPAR⁃γ和JNK通路，旨在发现GDM发病的分子机制和寻找GDM的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验分组及方案 接种BeWo细胞（购自中国协和医院细胞中心）于六孔板中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中培养，于对数生长期分别加入不同浓度的葡萄糖（0，5.5，10，30 mmol/L，Sigma公司）作用48 h，提取RNA，RT⁃PCR检测细胞visfatin、PPAR⁃γ mRNA表达；接种BeWo细胞于25 cm2培养瓶中培养，于对数生长期加入不同浓度的葡萄糖作用48 h，提取总蛋白，Western⁃blot检测细胞visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK蛋白表达；留取干预后的培养液，ELISA检测visfatin的分泌水平。

1.2 检测指标和方法

1.2.1 实时定量聚合酶链反应（RT⁃PCR）检测各组细胞visfatin、PPAR⁃γ mRNA表达 葡萄糖作用48 h后，每孔加入1 mL Trizol（Invitrogen公司）提取总RNA，各加入焦碳酸二乙酯（DEPC）水40 μL，分别测定吸光度A260和A280值计算纯度及浓度，A260/A280均在 1.8 ～ 2.0；按 FastQuant RT Kit试剂盒（TIANGEN公司）进行反转录；参照试剂盒说明建立PCR反应体系，PowerUpTMSYBR Green Master Mix（ABI公司）10 μL，Forward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，cDNA 8 μL，共20 μL反应体系，GAP⁃DH正向引物：5′⁃TGAACGGGAAGCTCACTG⁃3′，反向引物：5′⁃GCTTCACCACCTTCTTGATG⁃3′；PPAR⁃γ 正向引物：5′⁃GCCCTTCACTACTGTTGACTTCT⁃3′，反向引物：5′⁃CAGGCTCCACTTTGATTGC⁃3′；visfatin 正向引物：5′⁃TTGCCTTCGGTTCTGGTGGA⁃3′，反向引物：5′⁃AATTCCCTGCTGGCGTCCTA⁃3′采用ABI公司7300型荧光定量PCR仪检测visfatin、PPAR⁃γ mRNA相对表达量RQ值。

1.2.2 蛋白印迹（Western blot）法检测各组细胞中visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK蛋白表达 用预冷的PBS洗涤干预好的贴壁细胞2次，细胞刮收集细胞至离心管中，离心后加入RIPA裂解液（含1%的PMSF和蛋白磷酸酶抑制剂），4℃裂解1 h，12 000 r/min，4℃离心30 min，BCA法测蛋白浓度。取30 μg蛋白进行10%聚丙烯凝胶电泳，湿法电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2～4 h，按合适比例加入一抗稀释液（GAPDH抗体1∶5 000，visfatin抗体1∶250，PPAR⁃γ抗体1∶1 000，JNK 及p⁃JNK抗体1∶500稀释，各抗体属性均为兔抗），4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后加入1∶5 000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（SAB公司），室温孵育1 h，最后用ECL化学发光法检测各蛋白表达。图片灰度值采用IMAGE J软件分析，以目的蛋白灰度值除以内参灰度值以校正误差，所得结果代表该目的蛋白相对含量。抗体visfatin、PPAR⁃γ、JNK、p⁃JNK由Abcam公司提供。内参抗体GAPDH由Bioworld公司提供。

1.2.3 酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞培养液中visfatin分泌水平 按人visfatin ELISA试剂盒（ImmunoWay Biotechnology公司）说明检测visfatin的分泌水平。

1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0软件进行数据的统计学处理，结果以表示。进行正态性和方差齐性检验，各组间变量比较，采用单因素方差分析和 Student⁃Newman⁃Keuls post⁃hoc 两两检验。相关性分析采用Pearson相关性分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度葡萄糖对BeWo细胞visfatin、PPAR⁃γ mRNA表达的影响 与对照组相比，不同浓度的葡萄糖作用于BeWo细胞48 h后，visfatin mRNA表达均升高，呈浓度依赖性；PPAR⁃γ mRNA表达，仅30 mmol/L组明显升高（P＜0.05）。见图1。相关性分析表明，visfatin与PPAR⁃γ mRNA表达正相关（r=0.686，P=0.014）。

图1 葡萄糖作用48 h后visfatin和PPAR⁃γ mRNA表达结果Fig.1 The mRNA expression of visfatin and PPAR⁃γ affected by glucose for 48 h

2.2 不同浓度葡萄糖对BeWo细胞visfatin、PPAR⁃γ、p⁃JNK蛋白表达的影响 不同浓度葡萄糖作用于BeWo细胞48 h后，visfatin蛋白表达升高，呈浓度依赖性；PPAR⁃γ蛋白表达在不同浓度组呈降低趋势，但差异均无统计学意义；葡萄糖对JNK蛋白表达及磷酸化无明显影响。见图2。

2.3 不同浓度葡萄糖对BeWo细胞visfatin分泌的影响 BeWo细胞visfatin分泌水平较低，与对照组比较，各浓度葡萄糖组其分泌均无显著差异。见图3。

图2 各组细胞visfatin、PPAR⁃γ及p⁃JNK蛋白表达结果Fig.2 The protein expression of visfatin、PPAR⁃γ and p⁃JNK in BeWo cells

图3 各浓度组visfatin分泌水平Fig.3 The secretion levels of visfatin in all groups

3 讨论

多数研究表明［3-5］，GDM患者visfatin水平升高。有学者认为GDM患者visfatin表达降低［6］。另有研究［7］显示，GDM患者孕中期血清visfatin水平无变化。虽然存在争议，但均认为visfatin与GDM相关，但其具体作用机制还未阐明。关于visfatin与GDM的关系，目前国内外绝大多数都基于体内研究，本研究以BeWo细胞为模型，在细胞水平探讨葡萄糖对visfatin表达的影响及机制。该细胞系来源于人胎盘绒毛膜癌细胞，各项主要特征与滋养细胞类似，可在细胞水平提供胎盘的综合信息［7］。

本研究首次以葡萄糖干预模拟GDM患者高血糖模型，结果显示葡萄糖可促进BeWo细胞visfatin基因和蛋白表达，呈浓度依赖性，而对其分泌无明显影响。国内马瑶等［8］研究表明TNF⁃α作用于BeWo细胞后，其胞内visfatin表达降低，而胞外分泌增加，呈剂量依赖性，从而认为visfatin主要作为炎症因子参与GDM发病。本实验葡萄糖对BeWo细胞visfatin分泌无明显影响，且其分泌水平较低，表明高糖不能直接诱导visfatin分泌，虽然可促进visfatin基因和蛋白表达，但对JNK蛋白表达及磷酸化无明显影响，从而证明高糖不能通过JNK通路参与对BeWo细胞visfatin表达的调节。提示GDM患者JNK介导炎症和IR的机制，不能由高糖直接引起，可能是因肥胖和GDM孕妇体内IL⁃6、TNF⁃α等炎症因子水平升高，这些炎症因子通过激活JNK通路参与IR，还需今后进一步研究。

最近，有研究［9］认为胞外内脂素发挥促炎和致动脉粥样硬化作用，而其胞内作用与之相反，其胞内外功能的不同可能与胞内外烟酰胺腺嘌呤二核苷（NAD）的作用有关，胞内NAD可激活脱乙酰酶（sirtuins），通过组蛋白的脱乙酰作用调节靶基因转录，而胞外NAD可结合并激活胞外受体从而引发炎症反应。Visfatin也叫烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nampt），是NAD生物合成的限速酶，NAD是一种重要的辅酶，参与多种氧化还原反应，通过电子转移参与ATP生成，对维持机体能量代谢起重要作用［10］。NAD还可通过调节依赖NAD的sirtuin⁃1活性上调脂联素的生物合成，进而改善肝脏、脂肪组织和骨骼肌对胰岛素的敏感性［11-12］。Sirtuin⁃1还可增加由葡萄糖刺激的胰腺β细胞胰岛素分泌［13］，当visfatin表达降低时可损害胰岛素分泌，进而使血糖调节受损。本研究显示高糖状态下，BeWo细胞visfatin表达增加，可能通过反馈机制增加胰岛素分泌，维持血糖平衡。此外，visfatin还具有胰岛素模拟活性，能与胰岛素受体结合发挥降糖作用［5，14-15］。

本研究表明，高糖主要促进BeWo细胞内visfatin表达，而对其分泌无明显影响，由此推测GDM患者胎盘滋养细胞visfatin表达上调主要对维持滋养细胞能量代谢和胎盘功能起重要作用，还可通过调节NAD的合成和sirtuin⁃1的活性维持血糖平衡，作为GDM的保护因子。本研究发现高糖促进BeWo细胞visfatin和PPAR⁃γ mRNA表达，且二者表达正相关。国外一项研究［1］表明，在人巨噬细胞visfatin是PPAR⁃γ的一个靶基因，其配体可以PPAR⁃γ依赖方式上调visfatin的表达。因此，噻唑烷二酮类药物可通过激活PPAR⁃γ来上调visfatin表达，可能为GDM的预防和治疗提供新的靶点。

综上所述，本研究表明高糖可促进BeWo细胞visfatin基因和蛋白表达，PPAR⁃γ可能在转录水平上调visfatin的表达，但其对visfatin及糖代谢的具体作用机制尚需进一步研究。