黄芪多糖对2型糖尿病大鼠骨骼肌氧化应激水平及SIRT3表达的影响

贺映侠 朱 虹

(武汉市中心医院老年科，湖北 武汉 430000)

2型糖尿病(T2DM)的发病机制尚未完全阐明，研究表明活性氧(ROS)大量累积后加重胰岛 β 细胞氧化应激状态，并通过磷酸化胰岛素信号转导靶蛋白、上调炎性因子表达等方式介导肝脏、脂肪、肌肉组织胰岛素抵抗(IR)，在糖尿病(DM)发展的各个阶段起到重要作用〔1～3〕。氧化应激可能密切参与T2DM的发病过程。去乙酰化酶(SIRT)3是一种线粒体蛋白，通过对线粒体内相关乙酰化蛋白去乙酰基作用等方式减少细胞ROS水平，SIRT3的特性主要表现在能够使超氧化物歧化酶(SOD)的活性上升，促使细胞自由基水平降低和机体抗氧化应激能力提高〔4,5〕。黄芪多糖(APS)是从豆科植物黄芪中提取的大分子复合物〔6〕。研究表明，APS治疗DM有较好的效果，其机制可能与增强胰岛素功效、调节细胞因子水平、预防糖尿病并发症有关，但具体机制尚不清楚〔7〕。那么，APS改善DM患者病情能否通过升高SIRT3的表达和提高机体的氧化应激能力实现尚未明确。本文旨在探讨APS对T2DM大鼠骨骼肌中SIRT3 mRNA表达、氧化应激因子水平及蛋白表达的影响。

1 材料和方法

1.1材料和试剂 APS购自天津赛诺制药有限公司，链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，SOD、丙二醛(MDA)、ROS、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH)和胰岛素试剂盒购自南京建成生物工程研究所，血糖仪和血糖测定试纸由美国罗氏诊断公司提供，逆转录及PCR试剂盒由日本Takara公司提供；美国Santa Cruz公司生产的SIRT3抗体，考马斯亮蓝试剂盒和电化学发光法(ECL)显影液购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2实验动物及分组方法 SD大鼠50只，均为雄性，体重180～200 g，平均(191.78±4.63)g。取10只大鼠作为对照组，给予普通饲料喂养；使用高糖高脂饲料喂养另外40只大鼠，时间为4 w，造IR大鼠模型，然后将30 mg/kg的STZ进行腹腔注射，而将等体积的无菌柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液腹腔注射到对照组大鼠体内。高脂饲料和普通饲料分别给予造模组和对照组大鼠，时间为2 w，检测血糖及空腹胰岛素(FINS)水平前禁食8 h，然后按照2 g/kg的剂量灌服20% D-葡萄糖溶液，进行口服糖耐量试验，将血糖(0 min)>7.0 mmol/L和血糖(120 min)>11.0 mmol/L的大鼠判定为造模成功〔8〕。随机将40只造模成功的大鼠分成模型组和低、中、高剂量组，每组10只。对照组和模型组均腹腔注射100 mg·kg-1·d-1的生理盐水；APS低、中、高剂量组分别予100、200、400 mg·kg-1·d-1的APS。8 w后对所有大鼠进行检测，实验所用大鼠由武汉大学动物实验中心提供。

1.3体重、血糖及FINS的测定 8 w后测定各组大鼠体重并且尾静脉取血，空腹血糖采用血糖仪测定，FINS采用胰岛素试剂盒检测。

1.4骨骼肌组织中SOD、MDA、ROS活性及GSH含量测定 用3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，心脏处取血，再行处死，将腓肠肌匀浆，严格按照试剂盒的说明书进行操作。

1.5实时荧光定量PCR法检测SIRT3 mRNA的表达 用RNA保存液储存骨骼肌，采用美国Invitrogen公司提供的Trizol提取骨骼肌细胞中总RNA，严格按照ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒说明书进行操作，将其逆转录为cDNA，SIRT3的引物序列如下：上游5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′，下游5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′;β-actin:上游5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′，下游5′-CCAGGGAGGAAGAAGATGCG-3′ 。用日本Toyobo Co.Ltd提供的SYBR®Green Realtime PCR Master Mix定量试剂盒，应用Roche,Light Cycler 480 Instrument RT-PCR仪进行扩增。内参为β-actin，应用2-ΔΔCt进行半定量计算。

1.6Western印迹法检测SIRT3蛋白表达 保持0℃的温度，将肌肉迅速分离，1.0 ml细胞裂解液裂解肌肉组织，4℃ 15 000 r/min离心30 min，分离上清液，采用BCA法将蛋白定量至相同浓度，上样量为40 μg/每孔，采用12% SDS-PAGE进行凝胶电泳，PVDF膜上负载样品，封闭液为5%脱脂奶粉，时间为1 h，加入TBST稀释的SIRT3一抗(工作浓度1∶500)在4℃下过夜反应，用TBST冲洗膜3次，加入二抗后，在室温下孵育1 h，再用TBST冲洗膜3次，ECL进行显色，然后压X光胶片1～5 min，显影、定影，应用Image J软件统计条带的灰度值，分析结果参考目的条带与β-actin灰度值的比值。

1.7统计学方法 应用SPSS20.0软件进行单因素方差分析和t检验。

2 结 果

2.1APS对体重、血糖、FINS及SIRT3 mRNA表达的影响 各组体重、血糖、FINS及SIRT3 mRNA表达水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。多重比较：模型组体重及肌肉组织中SIRT3 mRNA表达水平均明显低于对照组，而血糖及FINS水平显著高于对照组(P<0.05)。APS干预后，三个不同剂量给药组体重和肌肉组织中SIRT3 mRNA表达水平均明显高于模型组，而血糖及FINS水平显著低于模型组(均P<0.05)。高剂量组的血糖及FINS表达水平显著低于低剂量组和中剂量组，体重和SIRT3 mRNA水平高于低剂量组和中剂量组(P<0.05)。见表1。

表1 各组体重、血糖、FINS及SIRT3 mRNA、SOD、MDA、SOD以及ROS活性水平比较

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；与高剂量组比较：3)P<0.05

2.2APS对SOD、MDA、GSH及ROS活性的影响 各组GSH、MDA、SOD、ROS水平整体比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组GSH和SOD水平明显低于对照组，但是MDA和ROS水平显著高于对照组(P<0.05)。APS治疗后，与模型组相比，各给药组GSH及SOD水平明显升高，而MDA水平显著下降(P<0.05)，高剂量组ROS水平较模型组显著下降(P<0.05)。其中GSH、SOD水平随着APS剂量的升高而升高(P<0.05)；高剂量组MDA水平显著低于低、中剂量组水平(P<0.05)，高剂量组ROS水平显著低于低剂量组水平(P<0.05)。见表1。

2.3APS对SIRT3蛋白表达量的影响 与对照组(0.67±0.10)比较，模型组肌肉中SIRT3蛋白表达量(0.29±0.06)显著降低，经APS治疗后，大鼠肌肉组织中SIRT3蛋白表达量显著高于模型组(低、中、高剂量组分别为0.39±0.10，0.42±0.14，0.52±0.16；P<0.05)，但SIRT3蛋白表达量与APS之间并无剂量相关性(P>0.05)，见图1。

1：对照组；2：模型组；3：APS低剂量组；4：APS中剂量组；5：APS高剂量组图1 APS对大鼠SIRT3蛋白的影响

3 讨 论

T2DM患者存在骨骼肌IR，降低葡萄糖的消耗量〔9〕。本研究结果发现APS可有效降低DM大鼠的血糖、FINS水平，增加大鼠体重。既往研究认为APS利于维持胰岛β细胞的正常运转，包括降低IR作用、稳定血脂代谢、提升胰岛素分泌量和降低血糖浓度〔8〕。数据表明，T2DM并发症的整个发展过程中均伴随氧化应激〔10〕。高血糖和脂肪酸刺激ROS的产生，提高代谢组织对胰岛素的抵抗性，使得β细胞功能衰退，增加葡萄糖的耐受量，最终诱发DM〔11〕。GSH、SOD是细胞内重要的还原剂，能有效清除过氧化代谢产物，阻断脂质过氧化反应〔12〕。MDA、ROS是判断氧自由基产生和组织损伤的重要生物标志物〔13〕。

本研究提示DM模型大鼠体内氧化应激水平显著升高，氧化应激可能参与DM的发病机制，而APS处理组可以显著降低DM大鼠体内的氧化应激水平，同时减轻大鼠DM的严重程度，其治疗作用可能与减轻体内氧化应激水平介导有关。SIRT3作为一种由线粒体产生且依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙酰化酶，主要在代谢活跃的组织表达，如肌肉、肝脏、心脏和脂肪组织等，具有去乙酰基酶活性。SIRT3的下降或活性改变可能与肥胖及IR相关疾病的发病相关。本次研究发现APS治疗后T2DM大鼠骨骼肌组织SIRT3 mRNA及蛋白含量增加，同时大鼠的疾病程度有了不同程度的减轻，这表明APS能够上调骨骼肌组织中SIRT3的表达量和抗氧化应激水平，进而提高胰岛素的敏感性，控制DM大鼠病情。研究表明，SIRT3能减少细胞内ROS水平依赖于SOD-2，SIRT3通过去乙酰化SOD两个关键的赖氨酸残基，增强其抗氧化活性〔14,15〕。另外，Sundaresan等〔16〕认为，SIRT3通过阻滞开放的方式调节位于线粒体渗透转运孔(mPTP)中的亲环蛋白。但是APS具体如何通过SIRT3调节氧化应激水平仍需进一步深入研究。

综上所述，APS降低DM大鼠血糖水平及IR的作用机制为缓解氧化应激状态，提高SIRT3的表达，但是具体下游信号通路需要进一步研究予以明确。