生脉饮调控糖尿病模型大鼠心肌脂质代谢作用机制研究

石佳娜 叶佐武 徐金波 鲁春芳 杨秀丽

作者单位：1浙江省人民医院药学部（杭州 310014）；2杭州医学院附属人民医院药学部（杭州 310014）；3浙江省立同德医院药学部（杭州310012）

糖尿病是胰岛素抵抗和胰岛素缺乏导致的以高血糖为主要特征的代谢紊乱综合征，易引起心、脑、肾等并发症。糖尿病状态下血浆游离脂肪酸异常增高，心肌耗能增加，葡萄糖代谢下降，脂肪酸代谢增加，心脏内过量的脂肪酸摄取和氧化导致心肌内脂肪代谢产物的积聚，引起心脏脂质毒性，并在此基础上出现氧化应激，导致细胞凋亡、内皮功能紊乱、炎症反应增加，同时出现心肌的损伤，心肌的结构和功能均发生改变[1-2]。项目组前期实验发现生脉饮能改善糖尿病心肌脂质代谢[3]，为更进一步研究其作用机制，本实验拟采用Western blotting方法研究生脉饮改善链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病模型大鼠心肌脂质代谢的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 Wistar大鼠72只，雄性，SPF级，6周龄，体质量160～180g，北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2012-0001。

1.2 药品与试剂 生脉饮（江西济民药业，批号130201，规格 10mL/支）；链脲佐菌素（STZ）（美国sigma公司，批号031M1287V）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH（美国sigma公司，批号G5265）；磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）抗体（Cell Signaling Technology公司，批号 2532）；乙酰辅酶 A羧化酶（ACC）抗体（Abcam公司，批号ab45174）；羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA）抗体（Abcam公司，批号ab174830）；脂肪酸合成酶（FAS）抗体（Bioworld Technology公司，批号A0461）；核转录因子固醇调控元件结合蛋白（SREBP1）抗体（Abcam 公司，批号 ab28481）；饮用水（杭州祥符水厂）。

1.3 仪 器 5810R离心机，德国Eppendorf公司；Cobas c311血液生化仪，德国罗氏公司；蛋白质电泳及电转移装置，北京六一仪器厂；台式酶标仪，Bio-Tek公司；凝胶成像系统，Bio-Rad公司。

2 实验方法

2.1 动物模型制作 参照文献[4]方法，建立糖尿病大鼠模型，大鼠腹腔注射35mg/kg STZ。继续喂养1周后，测定空腹血糖，连续2次血糖≥l6.7mmol/L且有多饮、多食、多尿，表示造模成功。

2.2 分组与给药 72只雄性Wistar大鼠随机分成对照组、模型组、生脉饮预防组、生脉饮高、中、低剂量组六组，每组12只。对照组和模型组均给予饮用水12mL/kg灌胃，预防组造模前4周开始给予生脉饮12mL/kg灌胃，高、中、低剂量治疗组在造模成功后分别给予12、6、3mL/kg生脉饮灌胃，预防组合计灌胃19周，其余各组均连续灌胃15周。造模与给药期间，对照组给予普通饲料，其余各组均喂养高脂高热量饲料。

2.3 心脏系数及生化指标测定 各组给药结束后，大鼠禁食10h，腹腔注射10%水合氯醛0.35g/kg麻醉，腹主动脉取血，静置1h后分离血清，-20℃冻存待检。自动生化仪测定低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、载脂蛋白 A（ApoAⅠ）、载脂蛋白 B（ApoB）。处死大鼠后迅速取出心脏，用冷等渗盐水洗净，滤纸吸干，称重并记录，心脏系数=心脏质量/动物质量；将心脏标本编号后立即置入-80℃液氮中保存备用。

2.4 Western blotting检测心肌脂质代谢关键蛋白将心肌组织剪碎、碾磨后，细胞悬液转移至离心管，按步骤进行蛋白提取和浓度测定，将样本蛋白溶液分装，使每分装管中含有20～40μg的蛋白量，分装后-80℃冻存备用。取分装好的蛋白样本，补加三蒸水和 loading buffer（5×）至相同体积（一般为 10μL），煮沸5min使蛋白变性，上样。跑胶用聚丙烯酰胺凝胶电泳（1×Running buffer电泳，先 70V，30min，待样本跑至浓缩胶和分离胶交界处时，改为110V，90 min，直至溴酚蓝跑至胶外）。进行转膜、封闭、抗体孵育后，采用ECL化学发光法检测印迹膜，ECL试剂盒A液和B液按1:1比例混合，滴于干净玻璃纸上，将膜用吸水纸吸干后正面向着AB混合液，孵育1 min，置于曝光盒中，在膜的位置上覆盖上X光胶片，曝光后，取出胶片，放入胶片冲印机中，约3min后观察结果。产物条带用Gel Doc 2000型凝胶成像系统分析记录结果。检测磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）信号通路相关乙酰辅酶A羧化酶（ACC）、脂肪酸合成酶（FAS）、核转录因子固醇调控元件结合蛋白（SREBP1）、羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA）蛋白。

2.5 统计学方法 应用SPSS18.0软件，计量资料以均值±标准差（±s） 表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 各组大鼠心脏系数比较 模型组心脏系数高于对照组，生脉饮各剂量组心脏系数均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），且存在量效关系。见表1。

3.2 各组大鼠血脂比较 生脉饮预防组、高剂量组LDL低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。生脉饮预防组及各剂量组HDL高于对照组、模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。生脉饮预防组和各剂量组ApoAⅠ/ApoB均高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表 2。

3.3 各组大鼠心肌磷酸腺苷蛋白激酶（AMPK）信号通路相关蛋白比较

3.3.1 各组大鼠心肌磷酸化（p）-AMPK蛋白比较Western blotting结果显示，模型组大鼠心肌磷酸化p-AMPK表达较对照组低（P＜0.05），而生脉饮预防组能上调p-AMPK的蛋白表达（P＜0.05）。见图1。

3.3.2 各组大鼠心肌ACC、HMG-CoA蛋白比较Western blotting结果显示，生脉饮干预能下调糖尿病模型大鼠心肌 ACC（P＜0.05）、HMG-CoA（P＞0.05）蛋白表达。见图 2、3。

3.3.3 各组大鼠心肌FAS、SREBP1蛋白比较 Westen blotting结果显示，生脉饮干预能下调糖尿病模型大鼠心肌 FAS（P＜0.05）、SREBP1（P＞0.05）蛋白的表达。见图 4、5。

表1 各组大鼠心脏系数比较（±s）

表1 各组大鼠心脏系数比较（±s）

注：与对照组比较，△△P＜0.01，与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别对照组模型组生脉饮预防组生脉饮高剂量组生脉饮中剂量组生脉饮低剂量组鼠数12 12 12 12 12 12心脏系数（×100）0.2512±0.0196 0.3589±0.0164△△0.3236±0.0075**0.3274±0.0016**0.3328±0.0146**0.3400±0.0009*

图1 生脉饮对糖尿病模型大鼠心肌p-AMPK蛋白的影响

4 讨论

表2 各组大鼠血脂比较（±s）

表2 各组大鼠血脂比较（±s）

注：与对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；ApoAⅠ：载脂蛋白A；ApoB：载脂蛋白B

组别对照组模型组生脉饮预防组生脉饮高剂量组生脉饮中剂量组生脉饮低剂量组鼠数12 12 12 12 12 12 TG（mmol/L）1.53±0.63 3.26±2.22#3.35±1.98 3.44±1.74 2.28±1.43 3.19±1.36 TC（mmol/L）2.06±0.51 2.34±0.34 2.42±0.57 2.59±0.59 2.30±0.74 2.90±0.56 HDL（mmol/L）1.55±0.24 1.65±0.41 2.12±0.27**△△2.09±0.34*△2.21±0.32**△△2.48±0.34**△△LDL（mmol/L）0.25±0.096 0.42±0.14△△0.28±0.14*0.25±0.10*0.30±0.16 0.36±0.16 ApoAⅠ/ApoB 1.014±0.450 0.588±0.242△0.917±0.204*2.000±0.577**1.278±0.565**1.333±0.500**

《伤寒论》记载：“消渴，气上撞心，心中痛热”，“消渴病心积”。消渴病病久入络，损伤心络，导致阴阳气血亏虚，脏腑功能失调；中医认为，阴虚为消渴致病之本，兼夹湿热、燥热、瘀热等为病之标；益气养阴，化瘀通络为主要治法之一。生脉饮由党参、麦冬、五味子组成，具有益气复脉、养阴生津的功能；用于气阴两亏，心悸气短，脉微自汗。研究发现[5-7]生脉胶囊可改善慢性心衰心室重构，生脉注射液可提高糖尿病大鼠的血管内皮功能，改善心功能。

图2 生脉饮对糖尿病模型大鼠心肌ACC蛋白的影响

图3 生脉饮对糖尿病模型大鼠心肌HMG-CoA蛋白的影响

图4 生脉饮对糖尿病模型大鼠心肌FAS蛋白的影响

图5 生脉饮对糖尿病模型大鼠心肌SREBP1蛋白的影响

研究[8]发现，2型糖尿病患者心肌细胞内脂质水平是健康人的5～6倍。糖尿病状态下，由于胰岛素抵抗，心肌细胞中葡萄糖底物减少且脂肪酸水平增高，对脂肪细胞抑制减弱，脂肪酸的摄取超过了氧化的速度，导致脂质在心肌细胞内堆积[9-10]。研究[11-12]表明，AMPK激活（磷酸化）后才能增强组织对葡萄糖的摄取、脂肪酸的氧化及胰岛素敏感性，并可减少葡萄糖的输出及异生，减少胆固醇和甘油三酯的生成。AMPK在调节脂质代谢中起着重要作用：（1）抑制脂肪酸及胆固醇的合成。ACC和HMG-CoA是AMPK的两个靶蛋白，分别是脂肪酸和胆固醇合成过程中的关键酶。活化的AMPK可使其磷酸化，抑制其功能，从而对抑制肝脂肪酸和胆固醇的合成起关键作用。（2）增加脂肪酸氧化。激活的AMPK可以通过磷酸化作用抑制ACC，减少丙二酰辅酶A的合成，导致脂肪酸的氧化增强。（3）抑制脂解作用[11]。（4）AMPK激活后可通过抑制SREBP1而抑制FAS的活性，从而抑制脂肪酸的合成[12]。

本实验显示，生脉饮可能通过磷酸化激活AMPK，通过调节 AMPK 下游 ACC、SREBP、HMG-CoA、FAS等蛋白，从而改善糖尿病大鼠的脂质代谢。表明生脉饮改善STZ诱导糖尿病大鼠心肌脂质代谢作用可能与AMPK有关。但由于中药化学成分多且复杂，作用机制复杂，量效关系难以控制，本论文研究结果仅可为生脉饮改善糖尿病心肌脂质代谢提供思路和方法，为AMPK相关机制的进一步明确提供实验依据。