益气养阴活血方对高糖诱导的NRK-52E细胞代谢记忆的影响

章文星 杜月光 柴可夫

作者单位：浙江中医药大学基础医学院（杭州 310053）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常见的并发症之一。研究[1-2]显示，糖脂代谢紊乱在DN发病过程中起着重要作用，同时长期的代谢紊乱通过改变表观遗传修饰，激活持续的炎症反应，形成代谢记忆，从而造成血管损伤，引起血管并发症。而代谢记忆可能与DM患者瘀血的形成有关。中医认为，糖尿病属“消渴”范畴，主要病变脏腑在肺、胃、肾，其中肾脏最为关键，尤其多见肾阴不足。随着病情的发展，久病入络，瘀血阻滞，临床中久病的消渴患者常有肢体麻木，静脉曲张，甚至中风偏瘫等血脉瘀滞表现。益气养阴活血方是根据临床消渴患者常气阴不足兼瘀血阻滞的病机而形成的一张经验方，由黄芪、女贞子、葛根、丹参、制大黄等组成，临床研究及动物实验显示，该方治疗早期糖尿病肾病效果较好。本实验通过肾小管上皮细胞体外培养方式，从转录共激活因子P300（P300）、沉默调节因子 1（SIRT1）的 mRNA 表达水平，探讨益气养阴活血方干预及预防代谢记忆的作用机制。

1 材料

1.1 主要试剂和仪器 1g/L DMEM培养基，批号C11885500BT；胎牛血清（GIBCO），批号 1715752；scriptTMgDNAClear cDNASynthesis Kit试剂盒（BIORAD），批号 1725035；噻唑蓝（MTT）试剂盒（碧云天），批号 030917170511；α-平滑肌激动蛋白（α-SMA）抗体（Abcam），批号 ab21027；E-钙黏蛋白（ECadherin）抗体（Abcam），批号 ab76055；益气养阴活血方（黄芪、灵芝、女贞子、葛根、丹参、制大黄）（浙江中医药大学中医门诊部提供）。

1.2 益气养阴活血方含药血清制备 8周龄，体质量250～300g的纯种雄性SD大鼠20只（浙江中医药大学实验动物中心提供），生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016，使用许可证号：SYXK（浙）2013-0184，在SPF状态下普通饲料适应性喂养1周后，按体质量分层将大鼠随机分成含药血清组10只，正常对照组10只。含药血清组予益气养阴活血方（组成：黄芪20g，灵芝、女贞子各 10g，葛根、丹参各 20g，制大黄5g，共计85g生药。加5倍量水浸泡2h，煎煮1h，过滤药液，滤渣另加3倍量水煎煮1h，过滤药液，二次水煎剂混合后，浓缩成0.8g/mL）水煎剂灌服。通过体表面积换算大鼠每日灌药剂量为0.85mL/100g（6.8g生药/kg），每天9:00及15:00各灌胃1次，连续3天。正常对照组予生理盐水灌服。末次灌胃1h后处死大鼠，收集血清，-20℃冻存待用。

1.3 大鼠肾小管上皮细胞培养 正常大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞）[中国科学院上海生命科学研究院细胞库（SIBS）]。NRK-52E细胞常规培养于含10%胎牛血清1g/L葡萄糖浓度DMEM培养基中，显微镜下观察贴壁融合率达80%～90%时，以胰蛋白酶消化，制成细胞悬浮液进行传代、培养。

2 方法

2.1 细胞毒性检测 在96孔培养板中每孔接种1×104个细胞，含10%胎牛血清1g/L DMEM培养基37℃温育箱培养，显微镜下观察完全贴壁后开始实验培养。每组设置6个副孔，每孔加入200μL含10%胎牛血清的 30、35、40、50、60、70mmol/L 的高糖DMEM培养基，培养48h。培养终止后，去除原溶液，按组每孔加入100μL，葡萄糖低糖组加入含1g/L浓度葡萄糖的DMEM培养基，每孔加入MTT溶液10μL，37℃温育箱避光孵育4h。凋零孔组不加细胞培养，处理同低糖组。终止后每孔加入100μL Formanzan溶液，37℃温育箱避光继续孵育4h，在酶联免疫检测仪570nm测定吸光度，计算出抑制率，抑制率=（低糖组平均OD值-高糖组平均OD值/低糖组平均OD值-凋零孔OD值）×100%。抑制率最高且值≥50%为最佳制备高糖细胞模型浓度。

2.2 实验分组 根据细胞毒性实验检测结果，选取适宜的制备模型的高糖浓度，进行以下实验分组：低糖组予64h低糖，高糖组予64h高糖，短暂高糖组予16h高糖+48h低糖，高糖+中药血清治疗组予16h高糖+48h含中药血清高糖，短暂高糖+中药血清治疗组予16h高糖+48h含中药血清低糖。低糖组葡萄糖浓度为1g/L。各组均加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。

2.3 免疫组化法检测NRK-52E细胞α-SMA和ECadherin表达 将无菌的小圆片置于6孔板中，每组3个副孔，计数后每孔接种1.6×105个细胞，加常规培养基37℃温育箱培养24h，然后按2.2的方法置于37℃温育箱进行培养。培养终止后，PBS清洗，福尔马林固定，按试剂盒说明书加入一抗稀释液，4℃冰箱过夜。PBS清洗，加入二抗稀释液，进行DAB显色，蒸馏水终止反应，苏木素染色，脱水，透明，封片。检测α-SMA和E-Cadherin的表达。

2.4 RT-PCR法检测P300、SIRT1 mRNA表达 细胞培养同上。Trizol法提取RNA。测量OD 260/280值，值在1.8～2.0符合要求。按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，获得cDNA进行PCR扩增。PCR引物序列，见表1。

表1 PCR引物序列

2.5 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，两组间计量资料应用t检验，多组间计量资料采用方差分析，组间比较采用SNK检验，不符合正态分布的资料采用非参数检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组MTT OD值及抑制率结果比较 高糖浓

PCR扩增反应条件：预变性阶段温度及时间：50℃ 2min，95℃ 10min；扩增阶段温度及时间：95℃15s，60℃ 60s，95℃ 30s，共 40 个循环；后延伸阶段温度及时间：95℃ 30s，60℃ 15s。采用 2-Δct表示基因相对水平。度为60mmol/L时抑制率最高，是最佳制备高糖模型的浓度。见图1（封三）。

3.2 各组NRK-52E细胞α-SMA、E-Cadherin表达情况比较 高糖刺激后，NRK-52E细胞α-SMA表达显著升高，E-Cadherin随着高糖刺激时间增加表达逐渐降低。高糖刺激16h后改为低糖培养，α-SMA表达较正常组仍有明显升高，E-Cadherin表达较正常组略微减少。中药血清干预后，α-SMA表达减弱，高糖刺激时间越短，干预效果越明显，中药血清干预后E-Cadherin表达明显增加。见图2、3（封三）。

图1 各组MTT OD值及抑制率结果比较

图2 各组NRK-52E细胞α-SMA表达情况比较（Envision染色 ×200）

图3 各组NRK-52E细胞E-Cadherin表达情况比较（Envision染色 ×200）

图4 各组P300、SIRT1 mRNA表达比较

3.3 各组P300、SIRT1 mRNA表达比较 高糖刺激导致SIRT1 mRNA表达相对降低，P300 mRNA表达相对增加，与低糖组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。高糖组与短暂高糖组比较，SIRT1与P300 mRNA表达均未见明显差异（P＞0.05）。与高糖组相比，高糖+中药血清治疗组SIRT1 mRNA表达相对增加，P300 mRNA表达相对降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。与短暂高糖组相比，短暂高糖+中药血清治疗组SIRT1 mRNA表达相对增加，P300 mRNA表达相对降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）。高糖+中药血清治疗组、短暂高糖+中药血清治疗组比较，SIRT1与P300 mRNA表达均未见明显差异（P＞0.05）。见图 4（封四）。

4 讨论

随着我国人民生活水平大幅度提高，DM的发病率明显上升，尤其是2型糖尿病的发病率大大增加[3]。糖尿病肾病（DN）是糖尿病最为常见，也是主要的微血管并发症之一。临床上早期高血糖引起的血管损伤在血糖控制到正常水平后仍继续存在，并且可导致后期血管的病变，这一现象即称之为“代谢记忆”[4]，表观遗传[5]可通过修饰及调节基因的表达来改变代谢记忆。DM由于长期的糖脂代谢紊乱，激活了持续的炎症反应，促使肾小管上皮细胞氧化损伤和凋亡，最终引起肾间质细胞纤维化（tubular interstitial fibrosis，TIF）。高血糖下受损细胞可招募炎症介质，促进炎症基因转录，发生表观遗传。本实验在临床研究及动物实验取得明确疗效的前提下[6-7]，运用血清药理学，从细胞实验角度，通过高糖培养模拟代谢记忆，从表观遗传着手，探讨益气养阴活血汤对DN防治的部分作用机制。

上皮-间充质转化（epithelial-Mesenchymal transition，EMT）是TIF重要的发病机制之一，其中间充质细胞标志物α-SMA，上皮细胞标志蛋白E-carherin是肾小管上皮细胞纤维化的重要观察指标之一，在EMT过程中可表现为E-carherin的表达丢失及α-SMA的表达。本实验显示，在高糖刺激下，α-SMA表达较低糖组明显增加，提示出现转分化现象，同时细胞间质间紧密连接减弱，黏附分子E-carherin表达受抑制。细胞在高糖刺激16h后改为低糖培养，α-SMA表达较正常组仍有明显升高，E-Cadherin表达较正常组略微减少，提示细胞在高糖刺激后改为低糖正常培养后仍存在转分化现象。中药血清干预后，α-SMA表达减弱，E-carherin表达显著增强。结果显示益气养阴活血方对NRK-52E细胞纤维化有治疗作用。

转录共激活因子P300是一种重要的组蛋白乙酰化酶，而沉默信息调节子SIRT1是一种重要的组蛋白去乙酰化酶，组蛋白乙酰化修饰在表观遗传修饰中起重要作用[8]。RT-PCR结果显示，高糖组P300 mRNA表达较低糖组升高（P＜0.05），SIRT1 mRNA表达较低糖组下降（P＜0.05），但高糖组与短暂高糖组比较，SIRT1与P300 mRNA表达均未见明显差异（P＞0.05），提示短暂的高糖刺激，即可造成细胞的损伤，并且在短暂的高糖刺激后改低糖继续培养48h后仍存在转分化现象，可能存在对早期代谢状态的记忆效应[9]。在中药血清干预后，高糖+中药血清治疗组P300 mRNA表达较高糖组下降（P＜0.05），SIRT1 mRNA表达较高糖组上升（P＜0.05）。短暂高糖+中药血清治疗组P300 mRNA表达较短暂高糖组下降（P＜0.05），SIRT1 mRNA 表达较短暂高糖组上升（P＜0.05）。高糖+中药血清治疗组与短暂高糖+中药血清治疗组比较，SIRT1与P300 mRNA表达均无统计学意义（P＞0.05）。结果显示益气养阴活血方可能同时通过抑制P300，刺激SIRT1表达进行一个双向调节，从而延缓纤维化的发生发展。

本实验结果显示，益气养阴活血方含药血清干预后NRK-52E细胞P300表达下调，SIRT1表达上升调，同时α-SMA表达下调，E-carherin表达上调，提示益气养阴活血方可能抑制P300，同时刺激SIRT1表达，通过组蛋白乙酰化修饰的改变来抑制炎症相关基因转录[10]，减轻细胞凋亡及肾损伤。