乌司他丁对呼吸机相关性肺炎模型大鼠肠道通透性及细菌移位的影响

王瑞明

作者单位：杭州市中医院急诊科（杭州 310007）

肠道是人体最大的细菌库[1]，肠道黏膜是抵御细菌入侵的重要屏障且极易受损伤。危重患者由于缺氧、感染、应激等各种刺激使肠道屏障改变，通透性增高，肠道免疫功能抑制，肠内细菌和毒素移位，参与多器官功能障碍综合症（MODS）的发病。研究[2]表明，谷氨酰胺是肠道黏膜的重要能源物质，有保持肠黏膜完整性的作用。乌司他丁可以有效抑制炎症介质释放，保护重要脏器。本研究就乌司他丁及谷氨酰胺对呼吸机相关性肺炎（VAP）大鼠肠黏膜屏障及细菌移位进行探讨。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级雄性SD大鼠100只，体质量280～320g，由浙江中医药大学动物房提供，合格证号：SCXK（沪）2013-0016。

1.2 实验设备 光学显微镜（Olympus日本），石蜡切片机（RM2135型 德国），低温高速离心机（Beckman德国），SX-300S凝胶图像分析处理系统（上海小源科技有限公司），高效液相色谱仪（美国water公司），精密电子天平（Sartorius公司），电泳仪（Bio-RAD公司），代谢笼等。

1.3 实验药品与试剂 乌司他丁（广东天普生化医药股份有限公司，批号H20040476）、谷氨酰胺（辰欣药业股份有限公司，批号H20053877）、乳果糖标准品（上海源叶生物科技有限公司，批号6300817E7）和甘露醇标准品（国药集团化学试剂有限公司，批号S11049）。

2 实验方法

2.1 大鼠呼吸机相关性肺炎（VAP）模型建立[3]（1）经口气管插管：用16和18号静脉套管针制备气管导管。大鼠麻醉前禁食12h，用20%的乌拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小纱布将舌向左外侧上方轻轻拉出，头部尽量向上抬起，同时上下颌分开。在额戴式喉镜反射光照射下对准声门旋转插入自制气管导管，插入深度为套管针尾部与牙齿平齐。观察棉絮在气管导管口的起伏并用听诊器听双肺呼吸音以确定导管在气管内，将气管导管外层与大鼠上唇缝合固定，连接动物呼吸机控制呼吸。呼吸机参数设定为：潮气量（V）12mL/kg，呼吸频率 70 次/min，吸入氧浓度（FiO2）100%。为防止体位引起的肺不张，每隔30min行2～3次大V通气。股静脉插管，以3～5mL/h输入5%的葡萄糖盐水。（2）大鼠VAP模型制备：每只大鼠机械通气24h（无需使用肌松剂）后，竖起固定板＞45度，以微量注射器快速注入0.2mL 3×108cfu/L铜绿假单胞菌（PA）菌液和0.55mL气体，并保持体位5min。造模成功标准[3]：出现肺炎临床表现；肉眼观察大鼠肺叶可见不同程度的融合性出血性病灶；光镜下观察大鼠肺组织呈小叶性肺炎特征；外周血和肺泡灌洗液（BALF）细菌学培养阳性。

2.2 给药方法 将100只SD大鼠随机分为空白对

2.4 统计学方法 应用SPSS17.0软件统计，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用单因素方差分析及Dunnett’s法进行两两比较。计量资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肠道通透性（尿液L/M）比较 术后第5天24h尿液L/M五组比较差异有统计学意义（F=19.41，P＜0.01）。进一步两两比较，模型组 L/M 高于空白对照组（P＜0.01），其余三组则与空白对照组相似，但均低于模型组（P均＜0.01），见表1。照组、模型组、乌司他丁组、谷氨酰胺组、乌司他丁联合谷氨酰胺组，每组20只。除空白对照组外，其余各组大鼠均建立VAP模型，模型组、空白对照组大鼠予生理盐水静脉注射2mL/d。其余各组分别给予乌司他丁10万U/kg静脉注射2mL/d、谷氨酰胺0.75g/kg静脉注射2mL/d、乌司他丁加谷氨酰胺（剂量同上），连续给药5天。

2.3 检测项目 （1）肠道通透性：给药后第5天，各组大鼠经口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2mL，转代谢笼收集24h尿液。取10mL尿液加硫柳汞2mL置 -20℃冰箱保存。用HS色谱工作站对色谱图形进行积分处理。根据标准曲线计算公式算出标本中甘露醇及乳果糖浓度，从而计算得出乳果糖/甘露醇肠道通透性（L/M）。（2）肠系膜淋巴结培养：给药后第6天处死大鼠，在无菌条件下取数枚肠系膜根部淋巴结，经碾磨后置37℃培养箱孵育48h后鉴定菌种及统计菌落计数。菌落数超过100/g组织为细菌移位阳性。

表1 各组大鼠肠道通透性（尿液L/M）比较（±s）

表1 各组大鼠肠道通透性（尿液L/M）比较（±s）

注：与空白对照组比较，△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.01；L/M：乳果糖/甘露醇

组别空白对照组模型组乌司他丁组谷氨酰胺组乌司他丁联合谷氨酰胺组鼠数20 20 20 20 20 L/M 0.1592±0.0621 0.4496±0.1880△0.2622±0.0965*0.2490±0.0846*0.2193±0.0745*

3.2 各组大鼠细菌培养阳性率比较 模型组阳性率明显高于空白对照组（P＜0.01），其余三组均低于模型组（P均＜0.01）。培养结果主要为大肠杆菌为主的肠道寄生菌细菌，见表2、图1（插页）。

4 讨论

呼吸机相关性肺炎（VAP）是指应用机械通气治疗后48h和停用机械通气拔除人工气道48h内发生的肺实质的感染性炎症。呼吸机相关性肺炎的病因和发病机制较多，其中呼吸机相关性肺炎与肠道功能关系非常密切。肠道是机体最大细菌和毒素库，由于禁食等多种原因导致肠道菌群失调，屏障功能破坏，有可能成为VAP患者菌血症来源。肠道菌群的移位及肠黏膜的屏障作用与呼吸机相关性肺炎关系密切。

表2 各组大鼠细菌培养阳性率比较（%）

肠黏膜通透性增高是肠屏障功能受损的重要表现[4]，黏膜通透性增高出现在肠黏膜形态学出现改变之前。因此，通过检测肠黏膜通透性可以反映肠黏膜屏障功能，尿L/M比值可以有效反映肠道通透性的改变[5]。谷氨酰胺作为人体内重要的自由氨基酸之一，在维持肠道完整性和维持人体多种生理代谢方面起着重要的作用[6-7]。谷氨酰胺对危重患者的肠道保护作用已初步得到肯定[8]，它可以减轻肠屏障损害，防止肠源性感染[9-10]，抑制小肠黏膜萎缩[11]。乌司他丁具有很强的水解酶抑制作用，有抑制炎症介质的释放作用[12]。本研究显示，肠道通透性方面，与空白对照组比较，模型组L/M明显增大（P＜0.01），其余三组则与空白对照组相似，谷氨酰胺组L/M小于乌司他丁组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。细菌移位方面，模型组阳性率明显高于空白对照组（P＜0.01），其余三组低于模型组（P＜0.01），培养结果主要为大肠杆菌为主的肠道寄生菌。乌司他丁及谷氨酰胺对VAP肠道黏膜的通透性及防止肠道菌群移位有一定的作用。