黄芩素对顺铂抗宫颈癌作用影响的实验研究

吴三英 谭晓霞 毛其芬

作者单位：1浙江省丽水市妇幼保健院检验科（丽水 323000）；2浙江省立同德医院检验科（杭州 310012）

宫颈癌是发病率很高的妇科肿瘤，好发于40岁以下女性，手术和化疗目前仍是治疗宫颈癌的主要手段[1]。顺铂是一种广谱抗肿瘤化疗药物，对肺癌、结肠癌和宫颈癌等多种肿瘤都有疗效[2-3]。然而大剂量顺铂的副反应大，特别是耳毒性和肾毒性不容忽视[4-5]。本文探讨黄芩素对顺铂抗宫颈癌作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料 DMEM培养基（批号12491）购于美国Gibco公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（批号APOAF）、噻唑蓝（MTT，批号 M2128）、黄芩素（批号275667）和顺铂（批号 2210000）购于美国 Sigma-Aldrich。长寿因子 1（SIRT1）抗体（批号 2493）、p53 抗体（批号 2527）、乙酰化 p53抗体（批号 2525）、p53上调凋亡调节因子（Puma）抗体（批号12450）、活化型半胱天冬酶3（caspase-3）（批号39661）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（批号5174）购于美国Cell Signaling公司。增强型化学发光底物（ECL）试剂盒（批号 32106）购于美国 Pierce。脂质体 2000（批号11668019）购于美国 Invitrogen。

1.2 细胞培养 人宫颈癌细胞系Hela购于美国模式培养物典藏所（ATCC）。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养于37°C恒温培养箱中并通入5%CO2。

1.3 SIRT1质粒构建和转染 人SIRT1基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成SIRT1重组过表达质粒。SIRT1过表达质粒用脂质体2000按试剂操作说明书步骤进行转染，简要步骤如下：将2μg/mL质粒用脂质体2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的Hela细胞置于该无血清培养基孵育6h后弃去无血清培养基并加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基培养24h。

1.4 细胞活力检测 将质粒转染后的Hela细胞按5×103/孔接种在96孔板上，分为对照组、黄芩素组、顺铂组、顺铂+黄芩素组和顺铂+黄芩素+SIRT1质粒组。对照组为空质粒转染的Hela细胞不加药物培养48h，顺铂组为在空质粒转染的Hela细胞中加入2μmol/L的顺铂培养48h，黄芩素组为在空质粒转染的Hela细胞中加入10μmol/L的黄芩素培养48h，顺铂+黄芩素组为在空质粒转染的Hela细胞中加入2μmol/L的顺铂和10μmol/L的黄芩素培养48h，顺铂+黄芩素+SIRT1质粒组为在SIRT1质粒转染的Hela细胞中加入2μmol/L顺铂和10μmol/L黄芩素培养48h。药物处理完毕后在Hela培养孔中加入20μL 5mg/mL MTT再培养4h，小心吸去上清液，孔中加入150μL二甲亚砜，充分震荡后在570nm波长下用酶标仪检测OD值。Hela细胞活力抑制率计算公式：抑制率=（对照组OD-药物处理组OD）/对照组OD×100%。

1.5 细胞凋亡实验 将质粒转染后的Hela细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按1.4进行分组处理。处理完毕后按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书用Annexin-V对细胞进行染色孵育20min。之后采用流式细胞术检测Hela细胞的凋亡，凋亡诱导率用Annexin-V阳性细胞数占总细胞数的百分比表示。

1.6 Western blot实验 将质粒转染后的Hela细胞按2×106/孔接种在6孔板上，按1.4进行分组处理。药物处理完毕后将细胞用蛋白提取液提取总蛋白质。之后将提取的总蛋白质用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到醋酸纤维素膜上，用SIRT1抗体、p53抗体、乙酰化p53抗体、Puma抗体、活化型半胱天冬酶3和GAPDH抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.7 统计学方法 实验重复3次，实验数据用均数±标准差（±s） ，应用SPSS15.0统计分析软件进行处理，组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Hela细胞细胞活力抑制率、凋亡诱导率比较 MTT和流式细胞实验结果显示，顺铂+黄芩素组Hela细胞细胞活力抑制率和凋亡诱导率均显著高于顺铂组和黄芩素组（P＜0.05），见表 1。

表1 各组Hela细胞细胞活力抑制率和凋亡诱导率比较（%，±s）

表1 各组Hela细胞细胞活力抑制率和凋亡诱导率比较（%，±s）

注：与顺铂组比较，*P＜0.05；与黄芩素组比较，△P＜0.05；与顺铂+黄芩素组比较，▲P＜0.05

组别对照组顺铂组黄芩素组顺铂+黄芩素组顺铂+黄芩素+SIRT1质粒组孔数3 3 3 3 3细胞活力抑制率0 18.1±1.4 5.8±0.5 66.3±5.7*△25.7±2.1▲凋亡诱导率1.6±0.2 10.4±0.9 2.8±0.3 38.4±3.2*△14.5±1.1▲

2.2 黄芩素通过下调Hela细胞SIRT1表达水平提高其对顺铂治疗的敏感性 Western blot实验结果显示，黄芩素处理能明显抑制Hela细胞SIRT1表达水平，而顺铂处理对SIRT1表达水平无影响，见图1（插页）。为了探讨黄芩素发挥顺铂增效作用的机制是否和SIRT1的下调有关，笔者在Hela细胞中转染SIRT1质粒使SIRT1蛋白强制高表达。实验结果显示，黄芩素和顺铂联合能显著降低转染SIRT1质粒的Hela细胞细胞活力抑制率和凋亡诱导率（P＜0.05），见表1。

2.3 黄芩素通过SIRT1/p53途径增强顺铂对Hela细胞的杀伤活性 Western blot实验结果显示，顺铂处理能诱导Hela细胞p53的表达和乙酰化水平，而黄芩素单独处理虽不能直接诱导p53的活化，但能明显促进顺铂诱导的p53的乙酰化和表达水平的增加。然而转染SIRT1表达质粒后，黄芩素对顺铂诱导的p53的促进作用受到明显抑制，见图2（插页），表明黄芩素通过下调SIRT1的表达促进顺铂诱导的p53的乙酰化和表达水平的增加。另外，Hela细胞p53下游蛋白Puma在黄芩素和顺铂的联合作用下，表达水平显著提高，同时，黄芩素联合顺铂能显著诱导Hela细胞凋亡执行分子caspase-3的活化，而转染SIRT1质粒后，Puma蛋白表达和caspase-3的活化均受到显著抑制，见图3（插页）。

3 讨论

黄芩素是从天然药物黄芩根部提取的主要活性成分，具有抗过敏、抗菌、抗病毒的功效，近期研究还发现黄芩素具有一定的肿瘤抑制作用[6]，本研究发现，黄芩素联合处理能显著提高宫颈癌细胞在顺铂治疗下的细胞活力抑制率和凋亡诱导率（P＜0.05），表明黄芩素能作为一种辅助治疗药物增强顺铂对宫颈癌细胞的杀伤活性，降低顺铂的使用剂量。

SIRT1是一种组蛋白去乙酰化酶，在结直肠癌、乳腺癌、肝癌和宫颈癌等多种肿瘤细胞中发生过表达[7-10]。肿瘤细胞中的SIRT1能使p53、p73和FOXO等转录因子发生去乙酰化而使它们失去活性，从而抑制促凋亡蛋白表达对抗化疗药物诱导的凋亡[11-13]，因此SIRT1是提高肿瘤细胞化疗敏感性的潜在靶点。在SIRT1依赖的抗凋亡通路中，p53的去乙酰化发挥了重要作用。p53是细胞中一种不稳定蛋白，然而p53能在DNA发生损伤（顺铂治疗）时发生乙酰化修饰，而乙酰化的p53能稳定存在并具有转录活性，能诱导下游Puma等促凋亡蛋白的表达而使细胞发生凋亡[14-15]。然而SIRT1的高度表达能通过减弱p53的稳定性从而保护肿瘤细胞逃避药物诱导的凋亡信号。

本研究发现，黄芩素对顺铂协同抗宫颈癌活性依赖于细胞SIRT1的抑制。黄芩素通过抑制SIRT1表达从而减弱顺铂诱导的乙酰化p53发生去乙酰化失活，使Puma等下游促凋亡蛋白发生过表达而使宫颈癌细胞发生凋亡性死亡。