PCR荧光探针法在Y染色体微缺失检测中的应用

陈晴晴 李少英 冼嘉嘉 王燕超 黎青

不孕不育是一个严重的社会问题，不育占所有不孕不育病例的一半［1］。遗传因素导致的精子畸形是导致男性不育的主要原因［2］。Tiepolo 等［3］发现无精子患者有Y染色体长臂缺失，推测Y染色体q臂上有“精子生成因子”。精子发生是由许多Y染色体特定基因调控的重要生殖过程，这些基因大多位于人类Y染色体长臂的一个特定区域，被称为无精子症因子（azoospermia factor，AZF）区域，AZF区域有很多与精子生成相关的关键基因位点，其微缺失与男性不育有关。1992年Vogt等［4］发现AZF上存在a、b、c区，由于Y染色体上有Y染色体性别决定区（sex⁃determining region of Y⁃chromosome，SRY）基因，有Y染色体微缺失的患者可以将微缺失基因传递给下一代男性。陈暖等［5］研究认为Y染色体微缺失的基因检测对明确男性不育患者的病因和选择治疗方案具有非常重要的意义。这类缺失可以采用多重聚合酶链反应电泳法、探针检测法、基因芯片检测法或毛细管电泳检测法等方法进行检测［6］。目前临床实验室常用方法为多重聚合酶链反应电泳法，但是该方法操作较为繁琐且不能批量检测。本研究通过对比聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）荧光探针法和多重聚合酶链反应（multiplex poly⁃merase chain reaction，multiplex PCR）结合琼脂糖凝胶电泳检测法，比较2种检测方法的检测率和吻合度，探讨PCR荧光探针法检测Y染色体微缺失在临床上的应用价值。

1 材料和方法

1.1 临床资料

2016年6月至2017年6月到我院就诊的208例不育男性患者，年龄23～46岁，平均年龄32.8岁。根据世界卫生组织（World Health Organiza⁃tion，WHO）2010年第5版精液分析操作指南将208例患者分为正常精子症组、无精子症组和少精子症组。用multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法对208例不育患者的Y染色体无精子症因子进行检测。

1.2 方法

1.2.1 抽提DNA

208例不育患者各采集5 mL外周血并进行抗凝处理。采用 DNeasy®Blood&Tissue试剂盒（QIAGEN，德国）提取基因组DNA。

1.2.2 PCR荧光探针法

PCR荧光探针法采用透景生命科技股份有限公司的Y染色体微缺失检测试剂盒。分为A反应液和B反应液。A反应液检测的位点是SRY、SY84、SY127和SY225，B反应液检测的位点是ZFX/ZFY、SY86、SY134和SY254。主要包括3个步骤：核酸提取、PCR试剂配制和PCR扩增。PCR扩增条件如下：50℃ 2 min；95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，38个循环；72℃ 5 min。信号收集：在第三阶段60°C时收集FAM/VIC/ROX/Cy5信号，并保存相关文件。PCR实验仪器为ABI 7500型实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems®，美国）。检测位点及对应的AZF区域见表1。

表1 PCR荧光探针法检测位点及对应的AZF区域Table 1 Detection sites of PCR fluorescent probe and corresponding AZF areas

1.2.3 multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法

采用的是Promega的Y染色体微缺失检测方法。对Y染色体的短DNA片段进行扩增，通过5个平行PCR扩增检测Y染色体的20个序列标签。PCR 扩增条件如下：94℃ 2 min；94℃ 1 min、57℃ 30 s，72℃ 1 min，37个循环；72℃ 5 min。检测位点及对应的AZF区域见表2。

表2 multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳法检测位点及对应的AZF区域Table 2 Detection sites of multiplex PCR combined with agarose gel electrophoresis and corresponding AZF areas

2 结果

2.1 用PCR荧光探针法检测结果

无精子症组47例，检出微缺失1例；少精子症组61例，检出微缺失1例；正常精子症组未检出缺失型（图1，图2，图3）。

图1 无精子症组中1例PCR荧光探针法显示AZFabc缺失Figure 1 A case of AZFabc deficiency was detected by PCR fluorescence probe in azoospermia group

2.2 用multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法

无精子症组47例，检出微缺失1例；少精子症组61例，检出微缺失1例；正常精子症组未检出缺失型（图4）。其中应用PCR荧光探针法和multi⁃plex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法检测出的微缺失来自于相同的病人。

3 讨论

孙华宾等［7］分析了不育男性无精子因子基因检测结果，认为AZF区域微缺失是引起男性无精、少精子症的重要原因之一，对原发无精、少精子症患者在单精子注射（intracytoplasmic sperm injec⁃tion，ICSI）之前进行Y染色体微缺失检测。陈云等［8］在研究厦门地区男性无精子症患者Y染色体微缺失情况中发现无精子症患者AZF微缺失发生率约为10%，丑广程等［9］在研究Y染色体微缺失及临床应用中发现无精子症患者AZF微缺失发生率接近10%。在此次研究中无精子症检测率低于10%，原因可能是在纳入无精子症组的时候，没有做精液分析项目检测的不育患者没有纳入此次统计研究。在研究的过程中，有2例不育患者PCR荧光探针法检测为SY127/SY134及SY255/SY254位点缺失，1例为SY84/SY86位点缺失，由于这3例没有相应的精液分析结果无法分组所以没有纳入此次研究。

图2 少精子症组1例PCR荧光探针法显示AZFc缺失Figure 2 A case of AZFc deficiency was demonstrated by PCR fluorescence probe in oligospermia group

图3 正常精子症组1例PCR荧光探针法显示未缺失型Figure 3 A case of normal spermatozoa showed no missing type by PCR fluorescence probe

图4 multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法结果Figure 4 Results of multiplex PCR combined with agarose gel electrophoresis

multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法在临床上已应用多年，近年来荧光定量PCR技术也开始应用于临床。段晋燕等［10］研究实时荧光定量PCR技术在男性不育患者Y染色体微缺失检查中的应用，得出实时荧光定量PCR技术可用于Y染色体微缺失的检测，且对筛查不育症患者具有临床价值的结论，张媛媛等［11］研究利用荧光定量聚合酶链反应（quantitative fluorescence polymerase chain reaction，QF⁃PCR）筛查男性不育患者Y染色体微缺失，认为多重QF⁃PCR技术，一个反应即能检测样本的多个位点，并可提示性染色体是否存在异常，有助于男性不育患者尽早明确病因，也为后续的检查和治疗提供依据。2013年发布的关于Y染色体微缺失指南中提出了6个短串联重复序列（short tan⁃dem repeat，STR）位点［12］。本研究中PCR荧光探针法对SY86等6个位点进行检测，具体检测缺失位点为multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法检测AZF区域的20个位点。本研究结果显示应用PCR荧光探针法检测208例不育患者，无精子症组中1例是AZFabc缺失，少精子症组中1例是AZFc缺失，其他未检测到缺失，用multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测发现无精子症组中同一病例AZFabc缺失，少精子症组中同一病例是AZFc缺失，2种检测方法结果一致。崔瑾等［13］研究发现PCR荧光探针法检测Y染色体微缺失结果与multi⁃plex PCR结合琼脂糖凝胶电泳法检测结果相同，且该法的检测结果与临床诊断相符，因此PCR荧光探针法适用于Y染色体微缺失的临床实验室筛查。杨洋等［14］研究PCR荧光探针法检测少精子症和无精子症患者认为PCR荧光探针法在Y染色体微缺失检测中稳定快捷，结果可靠。

王健等［15］研究认为多重荧光PCR方法操作方便、结果准确、灵敏度高且重复性好，在Y染色体微缺失检测上有重要应用价值，实验所需时间和费用明显少于multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法，而且PCR荧光探针法可以基本排除男性不育患者Y染色体常见的微缺失，可作为临床筛查男性不育患者的推荐方法，若PCR荧光探针法检测有异常，可进一步用multiplex PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测法检测确认。由于PCR荧光探针法检测项目在本院开展时间不久，本研究纳入病例有限，还未能充分认识其与传统检测手段之间的优势，后期我们将继续扩大样本量以及多诊断中心合作，进一步研究PCR荧光探针检测法在临床上对AZF缺失区域的检出率及应用价值。