5⁃Aza⁃CdR对MDA⁃MB⁃231细胞PPAR⁃γ基因甲基化的影响

董家书 韦美德 周格琛 邓开凤 戴盛明

三阴性乳腺癌（triple⁃negative breast cancer，TNBC）约占所有乳腺癌的10%～20%［1］，因其侵袭力强，且缺乏有效的治疗靶点，而成为预后极差的恶性肿瘤。抑癌基因的甲基化改变是三阴性乳腺癌发生发展过程中的重要事件。文献报道，PPAR⁃γ基因可通过调节Wnt信号传导通路的表达抑制乳腺癌细胞的转移［2］。PPAR⁃γ是一种由配体激活的核转录因子，参与炎症信号通路如NF⁃KB、Ap⁃1、JAK⁃sTAT，抑制促炎介质的生成［3］。有研究认为细胞内PPAR⁃γ的表达是调节性T细胞抗炎作用所必须的［4］。5⁃氮杂⁃2⁃脱氧胞嘧啶（5⁃aza⁃2'⁃deox⁃ycytidine，5⁃Aza⁃CdR）是DNA甲基转移酶特异性抑制剂，通过与DNA甲基转移酶共价键结合，抑制DNA甲基转移酶I的甲基转移活性，除去抑癌基因启动子的甲基化，解除甲基化对抑癌基因的抑制，从而使抑癌基因再表达，发挥抑癌作用［5］。本研究拟选用不同浓度的 5⁃Aza⁃CdR 作用于乳腺癌MDA⁃MB⁃231细胞系，观察该药物对乳腺癌细胞PPAR⁃γ基因甲基化情况以及转录水平，以及对该细胞凋亡的影响，为探索乳腺癌化疗药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂材料

MDA⁃MB⁃231细胞购自中科院上海细胞库；RPMI 1640培养基、无菌PBS、胎牛血清和胰蛋白酶均购自美国GIBCO公司；5⁃Aza⁃CdR购自日本sigma公司，经无菌PBS溶解后分装，-80℃保存；DNA抽提纯化试剂盒QIAamp DNA Mini Kit（货号51304），重亚硫酸氢盐转化试剂盒EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit（货号 59824），均购自德国凯杰生物技术（上海）有限公司；总RNA提取试剂盒Mini BEST Universal RNA Extraction Kit（货号9767），逆转录试剂盒Mir⁃X miRNA First⁃Strand Syn⁃thesis Kit（货号 68313），PCR 试剂盒 PrimeScript™RT Master Mix（货号 RR036），均购自日本 Takara公司；PCR引物由大连宝生物公司合成。

1.2 细胞培养

MDA⁃MB⁃231细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液（含1%青霉素、链霉素），于5%CO2、37℃恒温培养箱培养。取对数生长期的MDA⁃MB⁃23l细胞种入35 mm培养皿中，培养过夜使细胞充分贴壁后，加入含5、10、15、20 μmol/L的5⁃Aza⁃CdR完全培养液处理细胞，对照组用不含5⁃Aza⁃CdR的普通完全培养液，并加入与药物相同体积的PBS缓冲液，培养48 h后收获细胞。

1.3 甲基特异性PCR（methylmion specific PCR，MSP）检测PPAR⁃γ基因甲基化情况

QIAamp DNA Mini Kit提取 5⁃Aza⁃CdR 处理细胞48 h后基因组DNA，EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kit进行重亚硫酸氢盐修饰并回收DNA，利用甲基化以及非甲基化引物进行PCR扩增。PPAR⁃γ基因甲基化引物和非甲基化引物见表1。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30 个循环；72℃延伸10 min，进行熔解曲线分析以确认产物的特异性，4℃维持至结束。

表1 引物序列Table 1 Details of primers

1.4 实时荧光定量PCR（real⁃time fluorescent quan⁃tive PCR，qPCR）检测PPAR⁃γmRNA表达水平

Trizol法提取药物处理48 h后细胞的总RNA，TAKARA逆转录试剂盒获得cDNA。PPAR⁃γ基因以及β⁃actin引物见表1。PCR反应条件为：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；72℃终延伸5 min，进行熔解曲线分析以确认产物的特异性，4℃维持至结束。

1.5 流式细胞仪检测5⁃Aza⁃CdR对MDA⁃MB⁃231细胞凋亡的影响

取生长对数期MDA⁃MB⁃231细胞，胰酶消化后细胞计数；含10%血清的RPMI1640培养液调整细胞悬液浓度至1×106个/mL接种于6孔板内，每孔2 mL，每组细胞3个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；24 h后更换培养液，实验组加入含不同浓度 5⁃Aza⁃CdR（5、10、15、20 μmol/L）的RPMI1640培养液；对照组加同等体积的培养液，孵育48 h后胰酶消化收集细胞；凋亡试验取1×106个细胞，冷 PBS（2～8℃）洗 2 次，用 500 μL 1×An⁃nexin V结合液重悬细胞，浓度为1×106cells/mL，向细胞悬液中加5 μL Annexin V⁃FITC染色液，轻轻混匀后于2～8℃避光条件下孵育15 min；加入10 μL PI染色液后轻轻混匀，2～8℃避光条件下孵育5 min，立即用流式细胞仪检测，实验重复3次。

2 结果

2.1 MSP检测PPAR⁃γ基因启动子区域甲基化情况

5⁃Aza⁃CdR 药物处理细胞后，PPAR⁃γ基因甲基化程度明显降低，与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。

2.2 MDA⁃MB⁃231细胞PPAR⁃γmRNA表达情况

药物作用48 h，RT⁃qPCR结果显示，与对照组相比PPAR⁃γmRNA 表达增加（P＜0.01）；随着实验组药物浓度的增加，PPAR⁃γmRNA表达略有增加，组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图2。

2.3 5⁃Aza⁃CdR 对 MDA⁃MB⁃231 细胞凋亡的影响

与空白对照组细胞相比，5、10、15、20 μmol/L 5⁃Aza⁃CdR处理组的细胞凋亡率分别为（14.1±2.3）%、（25.4±3.3）%、（32.7±2.8）%、（43.1±1.9）%，与对照组的（6.9±0.8）%相比，凋亡率增加（P＜0.05），药物处理组间均有明显差异（P＜0.05），见图3。

图1 5⁃Aza⁃CdR 对MDA⁃MB⁃231细胞PPAR⁃γ基因去甲基化的影响Figure 1 Effects of 5⁃Aza⁃CdR on PPAR⁃γdemethylation in MDA⁃MB⁃231 cells

图2 5⁃Aza⁃CdR 对 MDA⁃MB⁃231细胞 PPAR⁃γmRNA表达的影响Figure 2 Effects of 5⁃Aza⁃CdR on PPAR⁃γmRNA expression in MDA⁃MB⁃231 cells

3 讨论

乳腺癌是危害女性健康最常见的妇科肿瘤，而其中TNBC是恶性程度极高，预后极差的肿瘤，且对内分泌治疗不敏感［6］，至今仍然没有具有针对性的治疗方案。PPAR⁃γ是核受体基因超家族中的一员，在脂肪组织、结肠、脾脏及巨噬细胞中大量表达，并且通过配体依赖途径影响相关基因转录的方式［7］，影响乳腺癌的发生发展［8⁃9］。Abduljab⁃bar等［10］研究发现高表达的PPAR⁃γ与没有接受激素治疗的雌激素受体（estrogen receptor，ER）阳性肿瘤患者的生存期延长有关［10］。张洪斌等［11］对 40例乳腺浸润性导管癌组织的检测中亦发现，PPAR⁃γ表达高者，5年生存率平均为91%，弱阳性或阴性表达者，5年生存率平均为42%，差异有统计学意义。本课题组前期的研究结果发现乳腺癌组织PPAR⁃γ表达低于癌旁组织，且PPAR⁃γ在MDA⁃MB⁃231（ER⁃）细胞中的表达明显低于MCF⁃7（ER+）乳腺癌细胞［12］。综合以上结果，提示PPAR⁃γ低表达很有可能是ER阴性且5年生存率低的TNBC的重要因素。

图3 不同浓度5⁃Aza⁃CdR作用MDA⁃MB⁃231细胞48 h后凋亡率的变化Figure 3 Changes of the apoptosis rate of MDA⁃MB⁃231 cells after treatment with different concentrations of 5⁃Aza⁃CdR for 48 h

DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要方式之一，抑癌基因甲基化导致基因转录抑制，引起细胞代谢紊乱，是肿瘤发生的重要机制之一［13］。本课题组的另一部分研究结果表明乳腺癌患者PPAR⁃γ基因启动子甲基化程度显著高于健康对照。而基因异常甲基化导致的基因沉默是可以逆转的过程，应用甲基化酶抑制剂可以使基因发生去甲基化，恢复基因的表达［14］。许多研究已成功将 5⁃Aza⁃CdR应用于体外培养的乳腺癌、宫颈癌等细胞株中，逆转E钙粘蛋白（E⁃cadherin）、RAS相关结构域蛋白 2A基因（RAS associated domain family 2A，RASSF2A）和人Runt相关转录因子3（Runt related transcription factor 3，RUNX3）等多种抑癌基因启动子的甲基化状态，恢复其表达，抑制肿瘤的生长［15⁃17］。研究已证实，PPAR⁃γ低表达与该基因的启动子甲基化增加有关［18］。因此，本研究选用去甲基化药物 5⁃Aza⁃CdR 作用 MDA⁃MB⁃231 细胞。经检测，PPAR⁃γ甲基化水平明显降低，提示 5⁃Aza⁃CdR能够有效解除PPAR⁃γ基因甲基化。同时，RT⁃qPCR检测结果也显示，与对照组相比，药物处理组PPAR⁃γ表达水平显著增加，但不同药物浓度间无显著差异，提示PPAR⁃γ在低浓度（10 μmol/L）5⁃Aza⁃CdR处理时即可显著表达升高；然MDA⁃MB⁃231细胞凋亡增加却有剂量依赖性，提示PPAR⁃γ可能参与了诱导癌细胞凋亡的部分作用。在袁昱宁的研究中，作者利用5⁃Aza⁃CdR作用MDA⁃MB⁃231细胞后检测促进凋亡的E⁃cadherin、Wnt抑制因子（Wnt inhibitory factor 1，WIF1）基因表达上调，且呈时间依赖性逐渐升高，而抑制凋亡的β⁃连环蛋白（β⁃catenin）的表达随作用时间延长逐渐下降［15］；Long 等［19］的研究亦发现 5⁃Aza⁃CdR处理MDA⁃MB⁃231细胞后，特异AT序列结合蛋白 2（special AT⁃rich binding protein 2，SATB2）表达降低，miR⁃31表达升高，抑制了细胞的侵袭和转移。综合以上结果，提示5⁃Aza⁃CdR可有效提高抑癌基因的表达，从而抑制MDA⁃MB⁃231肿瘤细胞的生长。

综上，本研究提示，5⁃Aza⁃CdR 可有效降低PPAR⁃γ甲基化的水平，使其在mRNA转录水平表达增加，促进MDA⁃MB⁃231细胞凋亡，为表观遗传学药物5⁃Aza⁃CdR用于TNBC治疗提供更多实验和理论依据。