HR⁃HPV合并UU感染状况及与宫颈上皮内瘤变的相关性研究

何江耀 赵任龙 果海娜

在世界范围内，宫颈癌是女性第4位常见的恶性肿瘤，仅2012年全球发生宫颈癌近53万例，年死亡数高达27万，其中85%宫颈癌发生于发展中国家，且居于这些国家癌症死因的首位［1］。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染已被证实是宫颈癌发生的首要始动因素，其中99.7%的宫颈鳞状细胞癌被发现与高危型人乳头瘤病毒（high risk⁃human papilloma virus，HR⁃HPV）感染有关，而持续的HR⁃HPV感染是导致宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）并进一步引发宫颈癌病变的主要病因［2⁃4］。解脲支原体（ureaplasmaurealyticum，UU）为条件致病菌，可使宿主细胞膜及泌尿生殖道黏膜受损，进而影响细胞的生物合成及免疫功能［5］。UU感染使宫颈微环境产生不良变化可能是部分HR⁃HPV持续感染从而导致CIN发生的重要因素之一。本文通过对宫颈分泌物进行HPV分型检测以及UU⁃DNA检测，联合做薄层液基细胞学检查，分析探讨生殖道HR⁃HPV合并UU感染与CIN发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

收集2014年8月至2017年6月间于妇科门诊就诊的女性患者和健康体检者宫颈分泌物样本，共1 159例，年龄18～72岁，平均年龄35.6岁，均未进行过抗HPV及UU的治疗，显微镜下观察待测的宫颈分泌物样本中含脱落细胞为合格的标本，4℃冰箱内保存备用，合格样本方可进入实验程序行检测。

1.1.2 主要检测仪器及试剂

Luminex®200TM多功能流式点阵仪（Luminex公司，美国）；CFX96 TouchTM实时荧光定量PCR仪（BioRad公司，美国）；Mx3000P实时荧光定量PCR仪（Stratagene公司，美国），德国 Eppendorf公司5333 PCR仪；人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒（流式荧光杂交法）（上海透景生命科技有限公司）；解脲脲原体核酸检测试剂盒（PCR⁃荧光探针法）（中山大学达安基因股份有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 HR⁃HPV分型检测

本实验按HPV分型检测试剂盒说明书进行操作：将宫颈分泌物样本振荡，12 000 r/min离心5 min取沉淀，加入裂解液100℃煮沸10 min，取上清2 μL加入反应管中于5333型PCR仪上行PCR扩增，所得PCR产物与微球上交联的探针根据碱基互补配对的原理进行杂交，再加入荧光标记物以标记微球上的探针，最后在Luminex®200TM多功能流式点阵仪上检测荧光信号并进行判读，并记录实验结果。人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒可检测17种 HR⁃HPV亚型，分别是：HPV16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82。

1.2.2 UU核酸检测

按解脲脲原体核酸检测试剂盒说明书进行检测操作：将宫颈分泌物样本振荡，12 000 r/min离心5 min取沉淀，加入裂解液100℃煮沸10 min，取上清2 μL加入反应管中，用CFX96 TouchTM实时荧光定量PCR仪或Mx3000P实时荧光定量PCR仪检测待测样品并捕获荧光信号，并记录实验结果。参照说明书判定检测结果：如果增长曲线呈S型曲线且Ct值＜27，结果判定为阳性，该样品的UU DNA含量=样品的Qty/20基因拷贝；如果增长曲线不呈S型曲线或Ct值=30，判定为阴性，样品的UU DNA 含量＜5.0×102基因拷贝；如果27≤Ct值＜30，则为实验灰度区，需重复实验一次，若重复增长曲线呈S型曲线且Ct值＜30，判为阳性结果，否则为阴性。每批检测按试剂盒内提供的阳性质控品与阴性质控品作对照。

1.2.3 细胞病理学检查

在1 159例受检者中随机选择122例样本采用离心沉降式薄层液基细胞制片法制片，95%乙醇固定，经巴氏染色，封片，光镜观察。由2名有经验的病理医生进行阅片并作出相应诊断，病理诊断标准根据宫颈细胞学Bethesda系统（the Bethesda system，TBS）（2001）修订版内容对 CIN 进行分级［6］，同时将病理诊断≥CINⅠ即视为发生宫颈上皮内瘤变。

1.3 统计学处理

所有数据均以百分率（%）表示，使用SAS 9.0软件进行统计学分析。根据资料采用χ2检验和Fisher精确概率法进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HR⁃HPV亚型阳性感染情况

受检的1 159例女性内分泌物标本中，17种HR⁃HPV阳性感染者共243例，总阳性感染率为20.97%（243/1 159），其中HPV52亚型感染率最高，阳性感染率为 4.23%（49/1 159），其次为HPV16和 58亚型，阳性感染率分别为3.88%（45/1 159）和2.76%（32/1 159）；单一高危亚型阳性感染率为17.08%（198/1 159），多重高危亚型阳性感染率为3.88%（45/1 159）。各亚型的阳性感染情况见表1。

2.2 HR⁃HPV与UU合并感染情况

本次研究受检者中UU总阳性感染率为67.56%（783/1 159）。HR⁃HPV合并UU感染情况见表2，在783例UU阳性患者中，HR⁃HPV阳性188例，阳性率为24.01%（188/783）；在UU检测阴性的376例患者中，HR⁃HPV阳性55例，阳性率为14.63%（55/376），2组相比差异具统计学意义（χ2＝13.50，P=0.000 2）（表 2）；不同 UU⁃DNA载量组的HR⁃HPV检测结果见表3，UU≥103cop⁃ies/mL组 HR⁃HPV 阳性率占 23.42%（182/777），明显高于UU＜103copies/mL组阳性率 15.97%（61/382），2组相比差异有统计学意义（χ2＝8.59，P=0.003 4）。

2.3 HR⁃HPV亚型合并感染UU情况

HR⁃HPV亚型合并UU阳性感染情况如下：HPV26亚型合并UU阳性感染率达100%（1/1），但考虑其研究病例数过少，不具有统计意义；HPV16阳性患者中UU阳性感染率最高，为93.33%（42/45），其次为HPV39和HPV58，合并UU阳性感染率分别为85.00%（17/20）和84.38%（27/32）；HPV16与其它HR⁃HPV亚型组合并UU阳性感染率相比，HPV16阳性组合并UU阳性感染率显著升高，差异具统计学意义（χ2＝7.66，P=0.005 6）。

表1 HR⁃HPV各亚型的感染情况Table 1 The infection of HR⁃HPVsubtypes

表2 HR⁃HPV合并UU感染情况Table 2 The infection of HR⁃HPV combined with UU

表3 不同UU⁃DNA载量标本的HR⁃HPV检测结果Table 3 The infection of HR⁃HPV in different concentrations of UU⁃DNA

2.4 HR⁃HPV合并UU阳性感染的CIN发生情况

1 159 例受检者中随机选择122例行薄层液基细胞学检查。如表4所示，病理诊断为发生CIN者共23例，总CIN发生率为18.85%（23/122）。其中在HR⁃HPV合并UU阳性感染的患者中，CIN发生率41.9%（13/31）最高，较其他单纯感染及阴性对照组中的CIN发生率显著升高，差异具统计学意义（P＜0.05）。

表4 HR⁃HPV合并UU感染CIN发生情况Table 4 The influence of HR⁃HPV/UU co⁃infection on cervical intraepithelial neoplasia

3 讨论

HPV是一种双链环状的小分子DNA病毒，目前已发现的与人类生殖道相关的亚型有40余种，其中约有20种被证实与肿瘤的发生有关［7］。根据致癌风险的高低大致可分为HPV高危型人乳头瘤病毒（HR⁃HPV）和低危型人乳头瘤病毒（low⁃risk human papilloma virus，LR⁃HRV）其中 LR⁃HPV可引起宫颈良性病变，而HR⁃HPV引发宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌［8］。HPV分布具有区域特性，不同地区的HPV高发型存在差异。HPV16型致癌的风险最高，全球约55%～60%的宫颈癌是由HPV16引起的，而HPV52型和58型在亚洲的检出率较高［9］。长期的流行病学及循证医学研究已证实，HR⁃HPV感染是宫颈癌的主要原因，可以导致宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌发生，且有90%以上的宫颈癌中存在高危型HPV感染［10］。然而在体外细胞转化研究中发现，HPV仅能诱导人正常上皮细胞的永生化而不能使之充分向恶性转化［11］。因此，HR⁃HPV 的持续感染在CIN病变中起重要作用，且与宫颈癌的发生密切相关［12⁃14］。

解脲支原体是寄生于女性泌尿生殖道内较为常见的一种致病性病原菌，可引起女性尿道炎、盆腔炎等疾病［15］。相关研究报道，UU感染可能与CIN的发生有关，可协同促进宫颈癌前病变或宫颈癌的发生，在HR⁃HPV导致CIN或宫颈癌中发挥重要辅助作用［16］。通过检测分析HR⁃HPV与UU感染情况及与CIN发生的相关性，有助于探讨其引起宫颈癌变的可能作用机制，为宫颈癌的筛查及早诊早治提供理论依据及研究思路。

本研究受检的1 159例样本中，HR⁃HPV阳性率为20.97%（243/1 159），要低于陕西省榆林地区［17］HR⁃HPV的感染率25.85%（190/735），高于无锡地区［18］HR⁃HPV 的感染率 10.53%（1 288/12 226），而与东莞邵锦欢等［19］报道的 21.89%（4 466/20 400）相近，这也充分说明东莞地区的HR⁃HPV感染率相对处于一个中间水平，很可能与东莞地区人员结构复杂，来自全国各地有关。本研究中UU感染率为67.5%（783/1 159），这与李国立等［20］报道的结果相接近，而较王刚等［21］报道的UU培养阳性感染率49.66%（3 390/6 826）要高，可能与其UU的核酸检测法比培养检测敏感性更高有关。Lukic等［22］研究表明，UU感染可增加HR⁃HPV感染的风险，可能作为HR⁃HPV感染的辅助因子，在HR⁃HPV侵入宫颈上皮细胞及HR⁃HPV持续感染过程中起重要作用。本研究结果也表明，在UU阳性感染者中HR⁃HPV的阳性率（24.01%，188/783）显著高于UU阴性患者中HR⁃HPV阳性率（14.63%，55/376），且随着UU⁃DNA载量的增加，HR⁃HPV感染风险增加。UU的毒力因子主要由尿素酶、免疫球蛋白A（IgA）蛋白酶、磷脂酶A、磷脂酶C以及多带抗原基因等5种蛋白与产生过氧化物的酶系统构成，其吸附于机体后可通过损伤宿主细胞膜及泌尿生殖道黏膜屏障，继而影响细胞的生物合成及免疫系统，增加机体对于HPV的易感性，同时也增加了HPV感染的暴露机会［23］。此外本研究进一步发现，高致病性的HPV16亚型患者中UU阳性率最高，要显著高于其他各亚型中合并UU的阳性感染率（P＜0.01），提示UU感染可能更易增加HPV16亚型的感染风险。

针对本研究随机选取的122例样本进行薄层液基细胞学检查，细胞学检查结果显示，在被检测为UU阳性组中的CIN发生率（26.25%，21/80）明显高于UU阴性组（4.76%，2/42），此结果与以往的报道相吻合，UU感染与宫颈病变的发生及进展密切相关［16，22］；同时相较于其他单纯感染及阴性对照组CIN发生情况而言，在HR⁃HPV合并UU阳性感染的患者中CIN发生率显著升高，表明HR⁃HPV合并UU阳性感染可提高患者CIN的发生，与CIN病变密切相关。

综上所述，UU感染可增加HR⁃HPV感染的风险，且两者协同促进CIN的发生，但HR⁃HPV与UU是怎样一个协同机制导致病变发生，目前还不明确，有待更进一步深入研究。但在临床防治CIN时需重视HR⁃HPV与UU合并感染的情况。