不同茶树品种鲜叶固定样的体外抗氧化活性

郭嘉凤，田双红，易晓芹，贺群，谢念祠，沈程文

（国家植物功能成分利用工程技术研究中心，茶学教育部重点实验室，湖南省植物功能成分利用协同创新中心，湖南农业大学园艺园林学院，湖南长沙 410128）

茶树起源于中国云贵高原，为多年生常绿叶用作物。在茶树的鲜叶中，水分占75.0%，干物质为25.0%左右。茶叶的化学成分是由 3.5～7.0%的无机物和93.0～96.5%有机物组成。茶叶有机化合物或无机盐形式存在的基本元素有30余种。到目前为止，茶叶中经分离、鉴定的已知化合物有700多种，其中包括蛋白质、脂肪及其二级产物-多酚类、色素、茶氨酸、生物碱、芳香物质、皂苷等[1]。

群体育种亦称混合育种，与系统育种相并列。系统育种，从早期世代开始就进行株系选择，而群体选择，不在早代进行单株选择，而是以杂种群体状态自由栽培，直到后期世代才作单株选择，育成系统。以茶树单株营养体为材料，采用无性繁殖法繁殖的品种（品系）称无性系品种（品系），简称无性系。无性系茶树良种是优质茶生产的原料，其种质优良，萌发提早7～10 d，发芽整齐，内含物丰富，制茶品质优异，产量提高20.0～30.0%，效益比群体种高一倍，无性系良种茶园是茶产业竞争力的基础。

鲜叶是茶树顶端新稍的总称，包括芽、叶和梗。鲜叶又称生叶、青叶等。采摘下来的茶叶嫩梢经过不同的加工之后，便形成各种不同品质特征的成品茶。鲜叶是形成茶叶品质的物质基础。茶叶品质高低，主要取决于鲜叶质量的高低，制茶技术是否合理。因此，要制出优良品质的茶叶，首先必须了解鲜叶内含化学成分的性质。茶叶作为目前全球消费的主流饮品，引领着人类的生活向着生态、健康、和谐进发。茶叶不仅作为饮品，更具有神奇的保健治疗作用，国内外人士一直在探索茶叶这一神秘的天然抗氧化剂。茶叶中含有丰富的抗氧化物质，目前国内外关于茶叶的保健功效研究也主要集中在茶叶的抗氧化能力方面。研究表明，茶叶中的多酚类、黄酮类化合物，甚至一些微量元素如硒、锰等都具有一定的抗氧化作用[2]。研究表明，茶叶能有效清除自由基[3]，抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化能力[4]。这与其含有较高的抗氧化物有关，如茶黄素、没食子酸和黄酮等，尤其富含儿茶素，其含量占茶叶干重的 30.0%[5]。近年来，国内外对茶叶及其提取物的药理药效作用进行了大量的研究，研究表明茶叶及其提取物具有抗突变、防癌抗癌、清除自由基、抗氧化、免疫调剂、抗过敏、延缓衰老、降血糖、血脂及利尿等功能。其中，茶叶抗氧化、抗衰老作用是其最主要的功能之一[6]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验原料

龙井群体种和龙井43号（从龙井群体品种中采用系统选种法育成），采自浙江省余杭市浙江大学茶学试验基地，树龄6年；云南群体种和云抗10号（从云南群体品种中采用系统选种法育成），采自云南省普洱市云南茶科所品种资源圃，树龄6年。安化群体种和槠叶齐（从安化群体品种中采用系统选种法育成），采自湖南省安化县湖南省云上茶业有限公司茶园基地，树龄6年。实验采用6个不同茶树类型一芽二叶鲜叶固定样。

1.1.2 试剂

甲醇、碳酸钠、福林酚试剂、乙酸、乙二胺四乙酸、抗坏血酸、铁氰化钾、水杨酸、无水对氨基苯磺酸、30%过氧化氢、氯化高铁、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、无水乙醇、浓盐酸，国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），东京化工业株式会社；N-1-萘乙二胺盐酸盐，天津市化学试剂研究所；三氯乙酸，上海三爱思试剂有限公司；儿茶素标准品，上海哈灵生物科技有限公司，纯度：HPLC检测≥60%。以上试剂皆为分析纯。

1.1.3 仪器与设备

分析天平、混匀器、高效液相色谱仪、数据处理系统、液相色谱柱、101-1AB型电热鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；HH·W21·600型电热恒温水箱，上海启前电子科技有限公司；FA2104S型电子天平，上海恒平科学仪器有限公司；KQ3200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；WFZUV-2102PCS型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；DD5大容量离心机，西安禾普生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 茶汤的制备

称取0.075 g冷冻干燥样品用10 mL的100 ℃蒸馏水浸提，100 ℃水浴锅保温10 min，抽滤去除茶渣，待茶汤冷却后，定溶至25 mL。用10倍稀释法和2倍稀释法将茶汤稀释成不同浓度（另设纯度大于60%儿茶素阳性对照）。

1.2.2 抗氧化成分的测定

1.2.2.1 茶多酚含量的测定

多酚类物质测定采用Folin-Ciocalteu法[6]，其含量用mg没食子酸/mL茶汤表示。

1.2.2.2 儿茶素总量和咖啡碱的测定

儿茶素及咖啡碱含量的测定采用高效液相色谱（HPLC）法，以mg/mL表示。

1.2.2.3 没食子酸的测定

没食子酸含量采用高效液相色谱（HPLC）法测定，以mg/mL表示。

1.2.2.4 总黄酮的测定

总黄酮三氯化铝法测定，参考何书美等[10]的方法，以mg/mL表示。

1.2.3 体外抗氧化性能的测定

1.2.3.1 鲜叶固定样清除DPPH自由基研究[7]

DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517 nm有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学剂量关系的，因此可用于检测自由基的清除情况，从而评价鲜叶固定样的抗氧化能力。

将浓度为3、1.5、0.3、0.03、0.003 mg/mL的茶汤，分别取2 mL上述溶液于试管中，加入2 mL用无水乙醇配制的DPPH溶液。用力振摇混匀后置暗室中静置 30 min，于 517 nm 波长处测定吸光度。以纯度＞60%的儿茶素作为阳性对照。蒸馏水做空白对照。按下式计算DPPH清除率。

注：式中：Ax为加入样品溶液和DPPH后的吸光度；Ax0为样品溶液本底的吸光度；A0为DPPH-和蒸馏水的吸光度。

1.2.3.2 鲜叶固定样清除羟自由基研究[8]

通过Fenton反应产生-OH，水杨酸捕获-OH产生有色物质，该物质在510 nm有特征吸收，通过测定水杨酸捕获-OH所得到的产物，确定-OH的清除率。从而评价鲜叶固定样的抗氧化能力。

将浓度为3、1.5、0.15、0.015、0.0075 mg/mL的茶汤，分别取1 mL上述溶液于试管中，依次加入6 mmol/L FeSO4溶液1 mL、6 mmol/L水杨酸乙醇溶液1 mL，最后加入8 mmol/L H2O2溶液1 mL以启动反应，37 ℃水浴加热30 min后终止反应，于510 nm测定吸光度。以纯度大于60%的儿茶素为阳性对照。蒸馏水做空白对照。按下式计算-OH清除率。

注：式中：A”0为空白对照液的吸光度；A"x为加入样品溶液后的吸光度；A"X0为不加显色剂 H2O2样品溶液本底的吸光度。

1.2.3.3 鲜叶固定样清除亚硝基研究[9]

NO2-在酸性条件下与对氨基苯磺酸重氮反应后，再与N-1苯基乙二胺盐酸盐偶合生成紫红色络合物，在540 nm处有最大吸收，可用比色法测定NO2-的量。

分别吸取5 mg/L的NaNO2标准液2.0 mL于试管中，分别加入浓度为6、3、1.5、0.75、0.075 mg/mL的茶汤1 mL于试管中，常温下反应30 min，然后分别加入0.4%对氨基苯磺酸溶液 1.0 mL，摇匀静置5 min，再分别加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液0.5 mL，用水稀释至刻度，摇匀静置15 min后于538 nm波长处测定吸光度。以纯度大于60%的儿茶素为阳性对照。按下式计算亚硝基清除率。

注：式中：A'0为不加提取液时NaNO2吸光度；A'x为加入提取液后NaNO2的吸光度；A'X0为不加NaNO2时样品的吸光度。

1.2.3.4 鲜叶固定样的总还原能力研究[11]

原理为：K3Fe(CN)6+样品→K4Fe(CN)6+K4Fe(CN)6+Fe3+→Fe4[Fe(CN)6]，让鲜叶固定样在波长700 nm条件下测定吸光度A，A越大，则样品的还原力越大。

将浓度为3、1.5、0.15、0.015、0.0015 mg/mL的茶汤，分别取1 mL上述溶液于试管中，加入0.2 mol/L的磷酸缓冲液（pH=6.6）和1%铁氰化钾溶液各2.5 mL并混合均匀，混合液50 ℃保温20 min后，加入2.5 mL 10%三氯乙酸终止反应，3500 r/min离心分离10 min。吸上层清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%FeCl3，混合均匀，30 min后于700 nm波长处测定吸光度。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化成分

6个品种茶多酚、儿茶素、没食子酸、咖啡碱及总黄酮含量如下表1所示，安化群体种（23.66±0.02 %）的茶多酚含量在6个品种中最高，安化群体种、云南群体种及龙井群体种的茶多酚含量均分别高于其选育出的无性系良种，6个品种的茶多酚含量差异显著（p＜0.05）。儿茶素含量6个品种差异显著（p＜0.05），安化群体种（12.84±0.11 mg/mL）含量最高。6个品种中没食子酸含量差异显著（p＜0.05），云抗 10号（0.65±0.23 mg/mL）没食子酸含量最高，槠叶齐（0.18±0.03 mg/mL）最低。6个品种中咖啡碱含量差异不显著，其中云南群体种（3.74±0.14 mg/mL）含量最高。6个品种中云南群体种（14.55±0.15 mg/g）总黄酮含量最高，云南群体种及云抗10号（10.08±0.33 mg/g）显著高于其他4个品种（p＜0.05）。

表1 6个品种中主要抗氧化成分含量Table 1 The main antioxidant contents in 6 tea samples

2.2 对DPPH的清除作用

图1 对DPPH的清除效果Fig.1 The removal effect of DPPH

由图1可以看出随着茶汤质量浓度的增加，清除活性逐渐增大，表现出良好的剂量依赖关系。茶汤对DPPH自由基良好的清除效果是因为其所具有的酚羟基可有效捕捉并将氢供给自由基，自身转变为酚氧自由基。由于酚与连接苯环的p-π共轭作用对酚氧自由基具有特殊的稳定性，降低了自动氧化链反应的传递，从而对进一步氧化实现抑制[12]。

IC50值越小清除效果越好。龙井群体种在6个品种中的清除效果最佳，其中龙井群体种、安化群体种、云南群体种对DPPH的清除效果优于纯度大于60%的儿茶素，而槠叶齐、云抗10号、龙井43号对DPPH的清除效果均低于纯度大于60%的儿茶素。6个品种对DPPH的清除效果如下：龙井群体种＞安化群体种＞云南群体种＞槠叶齐＞云抗10号＞龙井43号。

2.3 对羟基自由基的清除作用

图2 清除羟基自由基的效果Fig.2 The effect of scavenging hydroxyl radicals

茶汤与纯度大于60%的儿茶素对-OH的清除率均随着质量浓度的增大而增大，但前者对-OH的清除率略低于纯度大于60%的儿茶素。儿茶素结构中的酚羟基可与产生-OH等自由基所必需的金属离子（如Fe2+、Cu2+等）络合，使自由基的产生受到抑制，进而影响脂质过氧化的启动，最终抑制活性氧的产生[8,13]。对于-OH而言，儿茶素上的氢原子可以与其结合成水，达到清除-OH的目的，而儿茶素的碳原子则因此成为碳自由基，并进一步氧化形成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物[14～18]。由图 2可以看出对清除-OH的 IC50茶汤浓度最低的是纯度大于 60%的儿茶素，其次是安化群体种，安化群体种在6个品种中的清除效果最佳，6个品种对-OH的IC50如下：安化群体种＞槠叶齐＞龙井43号＞龙井群体种＞云抗10号＞云南群体种。

2.4 对亚硝基的清除作用

图3 对亚硝基的清除效果Fig.3 The removal effect of nitroso

由图3可以看出，在质量浓度0.075～0.75 mg/mL范围内，茶汤对亚硝基的清除活性在迅速增加，之后随着质量浓度的增加清除活性缓慢增加，趋于90%。6个品种对亚硝基的清除效果均低于纯度大于60%的儿茶素，安化群体种清除亚硝基的能力略高于其他 5个品种。6个品种对亚硝基的IC50清除效果如下：安化群体种＞槠叶齐＞龙井 43号＞龙井群体种＞云抗 10号＞云南群体种。

2.5 总还原能力

图4 总还原能力Fig.4 Total reduction capacity

由图4可以看出在0.0015～3 mg/mL范围内，6个品种鲜叶固定样茶汤和纯度大于60%的儿茶素都具有较强的还原能力，随着质量浓度的增加，还原能力越强，6个品种的还原能力与纯度大于60%的儿茶素基本相近。表现出无性系良种优于其群体种。6个品种中还原能力高低大致为：槠叶齐＞安化群体种＞龙井43号＞龙井群体种＞云抗10号＞云南群体种。

3 结论

3.1 研究结果发现，不同类型茶树品种的生物活性成分、种类及抗氧化活性能力明显不同。安化群体种的茶多酚（23.66±0.02%）和儿茶素（12.84±0.11 mg/mL）明显高于其他品种；采用DPPH自由基清除能力，羟自由基清除能力、亚硝基自由基清除能力三种方法评价龙井群体种、龙井43号、云南群体种、云抗10号、安化群体种和槠叶齐6个品种的抗氧化能力，发现其均具有较好的抗氧化活性，其中安化群体种的抗氧化活性更强。

3.2 茶树是多年生木本植物，基因型高度复杂。杂种优势是生物界一种普遍现象，指遗传组成不同的2个亲本杂交产生的F1代在生长势、生活力、繁殖力、产量、抗性和适应性等方面超过其双亲的现象。系统育种从早期世代开始株系选择，而群体选择是以杂种群体状态自由栽培，直到后期世代才作单株选择。无性系茶树良种以茶树单株营养体为材料，采用无性繁殖法繁殖。而且生物体的生长发育是一个动态过程，每一个基因的表达调控受环境等因素影响深远，再加上研究材料的局限性，因此还不能对本次试验结果中个别群体种在抗氧化性能及理化成分高于其无性系良种，做出明确解释[19]。汪新兵等[20]研究的群体种和无性系良种加工开化龙顶茶品质对比实验中，采用高海拔鸠坑群体种加工的开化龙顶红茶品质最好，低海拔的鸠坑群体品种次之，翠峰和福鼎品种明显差于鸠坑群体品种。且茶树地方群体种对所处环境有较强的适应性，陈美丽等[21]人采用柳州地方资源圃群体种、福鼎大白茶、桂绿1号3个品种的鲜叶原料加工成柳州地方工夫红茶，并进行了地方群体种和无性系良种所制红茶的品质比较分析。综合分析表明，柳州地方群体种所制工夫红茶无论在感官品质上，还是生化成分含量上，均表现出与福鼎大白茶所制红茶品质相当，与桂绿1号所制红茶相比品质更优的特点。

3.3 茶叶中的多酚物质能有效地清除体内自由基，从而防止因自由基过剩而产生的生物大分子损伤，具有较强的抗氧化能力，是天然抗氧化剂的潜在资源。儿茶素对超氧阴离子具有消除效果，可降低血清中脂质过氧化物的浓度，从而在降血脂方面产生良好的效果。而且儿茶素对DPPH自由基良好抑制关系，可以在抗癌方面具有良好表现。而且通过研究发现儿茶素能够使运动时的动物更有效的利用脂肪酸作为能量的来源，减少糖酵解和乳酸的堆积，这对增强耐力及抗疲劳十分有利。东方等[22]比较不同程度茶叶的体外与体内抗氧化功能，结果表明：绿茶中的多酚含量高于红茶与普洱茶，而黄酮含量则低于红茶与普洱茶；红茶与普洱茶具有相当量的没食子酸，且含量均高于绿茶。体外清除DPPH自由基能力的大小依次为绿茶＞红茶＞普洱茶。三类茶均能显著提高小鼠血清与肝组织中的GsH-Px活性(p＜0.05)；绿茶与红茶均能显著提高小鼠肝组织中的SOD活性(p＜0.01)，普洱茶能显著降低血清与肝组织中的MDA含量(p＜0.05)。不同的发酵程度对茶叶中多酚组成、体外清除自由基作用及对小鼠的抗氧化功能具有显著影响。在发酵过程中产生的一些未知的高分子量多酚类物质（如儿茶素衍生物或聚合物）还有待于进一步的研究。

3.4 上述实验采用体外抗氧化模型，以纯度大于60%的儿茶素为阳性对照研究6个不同类型茶叶的抗氧化性能。结果表明，6个品种均具有较高的还原能力，并且对DPPH、亚硝基以及-OH都有一定的清除能力。其中当茶汤浓度大于 0.25 mg/mL时，槠叶齐清除DPPH的效果优于其他品种；达到特定浓度时无性系良种的清除效果均高于其群体种。随着茶汤质量浓度的增加，其体外抗氧化性也在不断的增强，表现出了良好的量效关系。6个品种的总还原能力与纯度大于60%的儿茶素基本相近，槠叶齐的总还原能力略高于其他五个品种。王昱筱等[23]以日常消费频率较高和加工工艺有较大差异的3种茶叶-绿茶、红茶和普洱熟茶为研究对象，经对3种茶叶在一般冲饮浓度下主要抗氧化成分多酚和黄酮类溶出量及相应体外抗氧化活性进行分析，其中，绿茶有较强的DPPH自由基清除作用，普洱熟茶有较强的 O2-清除能力，红茶对羟自由基的清除最强。周金伟[24]等，选用4类发酵类型共16种茶叶，以酒石酸亚铁法测定其茶多酚含量，高效液相色谱(HPLC)法测定儿茶素、茶黄素和没食子酸含量，三氯化铝法测定总黄酮含量，比较不同发酵类型茶叶的主要抗氧化成分含量的差异，采用ORAC法和DPPH-清除自由基能力法分别测定其体外抗氧化能力。试验结果表明，绿茶茶多酚含量（5.22±0.71 mg/mL）及儿茶素含量（3.52±1.03 mg/mL）显著高于乌龙茶、红茶和黑茶。随着发酵程度的加深，茶多酚及儿茶素含量明显降低。发酵过程中明显提高了红茶和黑茶中茶黄素和没食子酸的含量。由 ORAC法和DPPH法测得茶叶抗氧化能力大小分别为绿茶＞乌龙茶＞黑茶＞红茶，绿茶＞乌龙茶＞红茶＞黑茶。结合不同的加工工艺，选用更有优势的原料，提高茶叶品质。目前对茶鲜叶抗氧化性能的研究比较少，以及鲜叶经加工成成品茶后，抗氧化性能的变化还待进一步研究。