牛蒡根提取物BP1对Ⅱ型糖尿病大鼠症状的改善作用

2018-07-11 06:41陈希瑞宋歌陈靠山
现代食品科技 2018年6期
关键词:牛蒡阿卡胰岛

陈希瑞,宋歌,陈靠山

(山东大学生命科学院,山东济南 250100)

糖尿病(Diabetes mellitus,DM)通常指Ⅱ型糖尿病(TZDM)。2013年,杨文英教授在《新英格兰杂志》发表研究显示,我国成人糖尿病和糖尿病前期患病率分别为9.7%和15.5%,患病人数高达9240万和1.482亿,且发病率仍在逐年上升[1,2]。DM与多种病理生理机制相关,包括了肥胖、高血压、脂质代谢紊乱和胰岛素抵抗等[3]。DM可引起各种并发症,尤其是眼病、心血管病、肾病、神经病变[4~10],导致器官功能不全或衰竭,是糖尿病患者生命健康的主要危害。本世纪以来,对糖尿病的病因、病理及生理等方面的研究具有突破性进展。同时,口服治疗糖尿病药物也有相应的发展,除原有刺激胰岛素分泌作用及加强外周糖利用相关的降血糖药物外,不断有新类型的药物正在临床试用[11]。但这类药物可引发消化道症状、过敏、肝肾功能衰退以及甚至诱发充血性心力衰竭等多种疾病[12,13]。因此从中医药的角度来寻求更为安全有效的DM药物具有极其现实的意义。

牛蒡(Arctium lappa L.)菊科牛蒡属直根系二年生大型草本植物,其根鲜嫩多汁、营养丰富[14];既是一种食材,也被作为一种中药用于治疗疾病[15,16]。相关研究表明牛蒡提取物通过清除体内氧自由基,对CCl4诱导的肝损伤小鼠起到一定保护作用[17];牛蒡叶多糖通过清除DPPH自由基,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌均有较明显的抑菌作用[18];此外,牛蒡通过调节 Bcl-2,Bax蛋白的表达而抑制心肌细胞凋亡保护心肌细胞[19],牛蒡根水提物可以保护高血压大鼠血管内皮损伤[20],牛蒡子苷元能明显抑制大鼠C6胶质瘤生长[21]等。

中医治疗糖尿病的历史源远流长[22],中医将多饮、多食、多尿,久则身体消瘦或尿有甜味为主要症状的一类病症称为“消渴”。《名医别录》中记载牛蒡可“疗汗出、中风、面肿、消渴、逐水”。其中,消渴则指糖尿病的治疗。诸多研究表明,中药牛蒡对糖尿病大鼠有一定治疗作用。如,牛蒡子苷可以延缓并减轻糖尿病微血管病变[23];牛蒡子提取物可以减轻糖尿病大鼠肾脏病变[24]等。本文通过构建糖尿病大鼠模型,研究牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠空腹血糖的治疗作用。本文意在研究牛蒡多糖对 TZDM 的治疗作用,初步探究其作用机制,为其临床应用和后续制剂研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜牛蒡根,购于山东济南大润发超市;Wistar大鼠200 g~230 g(SCXK鲁20130009),购于山东大学医学院实验动物中心。

1.2 仪器与试剂

离心机SIGMA 4K15;电子天平FA2004N,上海民桥精密科学仪器有限公司;数显控温水浴锅GKC4,上海波洛实验设备有限公司;荧光定量PCR仪,赛默飞;罗氏血糖仪;Agilent 1100液相色谱仪,Agilent公司;Sephadex G-50葡聚糖凝胶,Pharmacia产品;链脲佐菌素(streptozotocin STZ),购于Sigma公司;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒,丙二醛(MDA)检测试剂盒;引物合成,华大基因。

1.3 方法

新鲜牛蒡根自然晾干后,切片打粉,过40目筛,按照1:8固液比,80 ℃热水浸提1.5 h,两次后,合并提取液,抽滤并减压浓缩至适当体积,4倍95%乙醇醇沉过夜,8000 r/min离心15 min,复溶后8000 r/min离心15 min取上清液,经过Sephadex G-50层析后,超纯水洗脱,收集洗脱液后,冷冻冻干,采用苯酚-硫酸法测定样品中寡糖含量90%以上[25],得到牛蒡根提取物牛蒡多糖,并命名为BP1。

购买的大鼠适应性饲喂1周后,于50只大鼠中随机抽取6只为正常对照组,给予普通饲料喂养,剩余大鼠高脂高糖饲料喂养 4周后禁食 12 h,腹腔注射STZ 35 mg/kg,正常组给予相同剂量的柠檬酸缓冲液。72 h后尾尖采血测空腹血糖,糖尿病模型标准为空腹血糖≥11.1 mmol/L。未成模大鼠再次注射 STZ 20 mg/kg,72 h后尾尖采血测空腹血糖。

对于已成模大鼠血糖稳定2周后用于实验。选择40只造模成功的大鼠,根据空腹血糖值,随机分组:阿卡波糖组、模型对照组、BP1 400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg共6组,每组6只。各组间体重和空腹血糖值方差分析无统计学显著差异。于给药前及给药后8周每周监测体重和空腹血糖,并记录各组大鼠死亡情况。给药8周后,乙醚麻醉大鼠,心脏取血,全自动生化仪测血糖值、总胆固醇及甘油三酯;同时,摘取右肾、胰腺称重后记录,于10%的甲醛溶液中固定,石蜡包埋并HE染色做切片观察,并电镜观察胰岛β变化。

另一半组织保存在液氮中,用于RNA的提取并逆转录和qRT-PCR所用引物如下表1所示[26],测定数据以±s表示,应用SPSS软件进行分析,p<0.05有统计学意义。

表1 引物列表Table 1 List of primers

2 结果与分析

2.1 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠死亡率(%)的影响

表2为灌胃期间各组大鼠的死亡率统计。实验结果表明,空白对照组无死亡情况,且行为活动比较正常;模型组死亡率较高,后期体能减弱,并发症比较严重。阿卡波糖组的情况较好,但是后期仍有白内障等并发症出现。牛蒡根提取物低剂量组与中剂量组的情况较好,无死亡情况。

表2 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠死亡率(%)的影响Table 2 Effects of burdock root extract BP1 on the mortality(%) of diabetic rats(±s, n = 6)

表2 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠死亡率(%)的影响Table 2 Effects of burdock root extract BP1 on the mortality(%) of diabetic rats(±s, n = 6)

注:阿卡波糖组、牛蒡根提取物BP1分别以200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg三个剂量连续灌胃8周,空白对照组给予相同量的蒸馏水,对大鼠的外观体征,行为活动,死亡数目等进行统计(不同小写英文字母代表显著性差异p<0.05)。

Group 0 w 1 w 2 w 4 w 6 w 8 w空白 0 0 0 0 0 0 Control 0 16.7 16.7 16.7 16.7 33.3a阿卡波糖 0 0 0 0 0 0c 400(低) 0 0 0 0 0 0c 600(中) 0 0 0 0 0 0c 800(高) 0 0 0 0 0 16.7b

2.2 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠体重的影响

表3为灌胃期间各组大鼠的体重数值统计。在处理第0周时,除空白对照组,其余各组体重无明显差异。在灌胃处理第三周后,各组大鼠体重开始出现显著性差异,其中模型组体重呈持续下降趋势,其余各组体重开始回升;在第8周时,模型组大鼠的平均体重仅为368.2 g,而案例组体重远高于模型组,分别为402.7 g、382.3 g及402.1 g。实验数据表明牛蒡根提取物BP1可以在一定程度上对大鼠的体重有维持并恢复的作用。

2.3 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠空腹血糖的影响

表4为灌喂处理期间各组大鼠空腹血糖值变化情况。实验第0周时,各组大鼠空腹血糖无明显差异。造模一周后,除空白对照组外,各组大鼠的空腹血糖值无明显差异。开始灌喂处理3周后,阿卡波糖组、牛蒡根提取物组与模型组开始出现显著性差异;第 8周后,模型组空腹血糖值为26.4 mmol/L,阿卡波糖组血糖值为19.3 mmol/L,其次为中剂量组22.6 mmol/L、高剂量组20.7 mmol/L及低剂量组21.6 mmol/L。实验数据表明,牛蒡根提取物BP1具有降低糖尿病鼠空腹血糖的作用。

表3 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠体重的影响Table 3 Effects of burdock root extract BP1 on the body weight of diabetic rats (±s , n = 6)

表3 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠体重的影响Table 3 Effects of burdock root extract BP1 on the body weight of diabetic rats (±s , n = 6)

注:阿卡波糖组、牛蒡根提取物BP1分别以200 mg/kg、400 mg/kg、600 mg/kg、800 mg/kg三个剂量连续灌胃8周,空白对照组给予相同量的蒸馏水,对大鼠体重进行统计(不同小写英文字母代表显著性差异p<0.05),下同。

group 0 w 1 w 2 w 4 w 6 w 8 w空白 380.5±37.40a 366.2±33.71a 388.6±38.91b 395.3±40.92b 389.5±45.27b 396.5±47.11ab Control 388.5±30.61a 368.0±30.56a 366.3±39.20c 368.8±43.64c 364.5±40.91c 368.2±42.31c阿卡波糖 388.0±19.20a 366.8±22.16a 421.5±18.36a 422.8±20.34a 420.0±15.62a 393.2±20.60ab 400(低) 395.0±22.32a 368.5±24.22a 413.0±25.44b 424.5±23.36a 425.5±24.81a 402.7±27.91a 600(中) 390.0±32.90a 362.5±31.45a 398.9±33.26b 400.5±32.27ab 385.8±31.90b 382.3±36.22b 800(高) 389.5±16.82a 364.5±20.31a 393.2±22.90b 402.6±15.26ab 395.9±15.58ab 402.1±30.43a

表4 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠空腹血糖的影响Table 4 Effects of burdock root extract BP1 on the blood glucose of diabetic rats (±s, n = 6)

表4 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠空腹血糖的影响Table 4 Effects of burdock root extract BP1 on the blood glucose of diabetic rats (±s, n = 6)

group 0 w 1 w 2 w 4 w 6 w 8 w空白 6.85±0.42a 6.42±0.42 6.3±0.50 6.5±0.40 6.4±0.40 6.4±0.50 Control 6.8±0.74a 19.8±0.88a 22.9±1.6a 23.8±1.41a 24.7±1.40a 26.4±1.13a阿卡波糖 7.0±0.56a 19.7±1.50a 21.3±2.0b 21.7±1.41c 21.6±1.42bc 19.3±1.05c 400(低) 6.8±0.45a 19.6±1.60a 22.3±1.80a 22.9±1.52b 22.7±1.54b 22.6±1.41b 600(中) 7.0±0.73a 20.1±1.60a 22.5±1.30a 22.7±1.90b 22.6±1.82b 20.7±1.62bc 800(高) 7.0±0.58a 20.0±2.10a 22.3±1.80a 22.9±1.81b 21.9±1.82bc 21.6±1.55bc

2.4 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠血清总胆固醇及甘油三脂的影响

图1、图2分别为糖尿病大鼠血清总胆固醇和甘油三酯在灌喂牛蒡根提取物前后的变化情况。在实验第0周时,除空白对照组,各分组之间无显著性差异;但实验第8周后,我们可以看出:模型组TC、TG含量分别高达1.82 mmol/L,1.57 mmol/L,而阿卡波糖组含量最高达1.32 mmol/L,1.28 mmol/L;牛蒡根提取物 400组与阿卡波糖组相近为 1.32 mmol/L,1.39 mmol/L;牛蒡根提取物600及800组TC,TG含量分别为1.41 mmol/L、1.48 mmol/L及1.35 mmol/L、1.42 mmol/L。

以上实验数据表明牛蒡根提取物可以显著降低血清中TC与TG的含量,具有调节血脂的作用。

图1 牛蒡根提取物BP1对大鼠总胆固醇含量的影响Fig.1 Effects of burdock root extract BP1 on the TG content in rats

图2 牛蒡根提取物BP1对大鼠甘油三酯含量Fig.2 Effects of burdock root extract BP1 on the TC content in rats

2.5 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠SOD及MDA含量的影响

实验结束后对各组大鼠SOD酶活及MDA含量进行统计,实验结果见图3、图4。表明牛蒡根提取物组MDA含量与模型组具有显著性差异(p<0.05),SOD酶活性高于模型组(p<0.05)。

图3 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠SOD酶活的影响Fig.3 Effects of burdock root extract BP1 on the SOD enzyme activity of diabetic rats

图4 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠MDA含量的影响Fig.4 Effects of burdock root extract BP1 on the MDA content of diabetic rats

2.6 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠IL-18、TNF-α基因表达的影响

实验结束后,取肾小球内皮细胞用于RNA的提取并逆转录;qRT-PCR所用引物见表1。白介素IL-18、肿瘤坏死因子TNF-α均是重要的促炎症因子。这些促炎症分子表达异常增高会促进糖尿病肾损害的进展。

图5 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠IL-18基因表达的影响Fig.5 Effect of burdock root extract BP1 on the IL-18expression in rats

图6 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠TNF-α基因表达的影响Fig.6 Effects of burdock root extract BP1 on the TNF-α expression of diabetic rats

由图5、图6可知,通过使用qRT-PCR检测IL-18、肿瘤坏死因子TNF-α的相对表达水平,结果表明了阿卡波糖组与牛蒡根提取物组的 IL-18、肿瘤坏死因子TNF-α的表达水平明显下调。

2.7 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠肾脏器官的影响

图7 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠肾脏器官的影响Fig.7 Effects of burdock root extract BP1 on the kidney organs of diabetic rats

牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠肾脏器官的影响见图 7。观察肾脏的病理组织学变化:糖尿病模型组大鼠的肾小球基底膜增厚,并出现新月体或者肾小球硬化的病症,间质内可见淋巴细胞、单核细胞浸润等。阿卡波糖组和牛蒡根提取物组可明显改善肾小球肥大、系膜扩增以及肾纤维化。

2.8 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠胰腺器官的影响

图8 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠肾脏器官的影响Fig.8 Effects of burdock root extract BP1 on the pancreas organs of diabetic rats

观察胰岛的病理组织学变化:空白组的胰腺组织结构清楚,外分泌部胰腺上皮细胞与内分泌部胰岛界限清楚;模型组胰岛结构紊乱疏松,形态不规则,可见不同程度的萎缩,胰岛面积明显变小且边缘不整齐,胰岛内细胞排列紊乱,数目明显减少,部分细胞胞浆空泡化,部分细胞核固缩。

阿卡波糖组与牛蒡跟提取物组胰岛结构轻度恢复,萎缩程度好转,边缘清晰,病变程度较模型组轻,胰岛数目及胰岛内分泌细胞数目均增加。综上所述,牛蒡根提取物BP1可明显改善胰腺的病理损伤。

2.9 牛蒡根提取物 BP1对糖尿病大鼠胰岛素的影响

图9 牛蒡根提取物BP1对糖尿病大鼠胰岛素的影响Fig.9 Effects of burdock root extract BP1 on the insulin of diabetic rats

通过透射电镜结果表明,模型组糖尿病大鼠胰岛内β细胞中胰岛素分泌颗粒与空白对照组相比明显减少,牛蒡根提取物BP1 600 mg/kg、牛蒡根提取物BP1 800 mg/kg组及阿卡波糖组均可以显著增加胰岛β细胞中胰岛素分泌颗粒。结果表明牛蒡根提取物BP1可以在一定程度上改变胰岛β细胞中胰岛素分泌颗粒的数量。

3 结论

3.1 Rosalia等[28]研究表明,牛蒡子、牛蒡根、牛蒡叶的体积分数70%酒精提取物均具有抗氧化的作用。本文通过检测糖尿病大鼠血清中MDA及SOD的含量,表明牛蒡根提取物组BP1 MDA含量与模型组具有显著性差异(p<0.05),SOD 酶活性高于模型组(p<0.05);通过HE染色发现牛蒡根提取物组肾脏及胰腺组织细胞形态要好于模型组,氧化损伤程度比较低,我们分析牛蒡根提取物BP1提高了细胞抗氧化能力,减少了细胞的氧化损伤;另外,我们检测了促炎症因子IL-18和TNF-α基因表达情况。qRT-PCR结果表明阿卡波糖组与牛蒡根提取物组 IL-18、肿瘤坏死因子TNF-α的表达水平明显下调,降低了糖尿病大鼠的肾脏细胞损伤情况。

3.2 为了研究牛蒡根提取物 BP1对糖尿病的治疗作用,本文分别对wistar糖尿病模型大鼠灌喂阿卡波糖200 mg/kg、生理盐水0.9%、牛蒡根提取物400 mg/kg、600 mg/kg及800 mg/kg处理,实验数据表明,牛蒡根提取物组糖尿病大鼠的死亡率显著低于模型组大鼠(p<0.05);灌胃期间,牛蒡根提取物可以在一定程度上对大鼠的体重有维持并恢复的作用(p<0.05);灌胃处理8周后,牛蒡根提取物组对糖尿病大鼠的空腹血糖具有显著降低的效果(p<0.05);同时,我们检测了牛蒡根提取物对血清甘油三酯及胆固醇是否有降低的作用,结果表明,牛蒡根提取物BP1可以显著降低血清中TC与TG的含量,具有调节血脂的作用(p<0.05);结果分析表明,牛蒡根提取物BP1提高了细胞抗氧化能力,减少了细胞的氧化损伤,抑制促炎症因子IL-18和TNF-α的表达,对胰腺和肾脏有一定的保护作用,并在一定程度上改善了胰岛素的分泌情况,从而改善糖尿病鼠的高血糖症状,对开发抗糖尿病的中药制剂奠定了理论基础。

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