老山芹不同溶剂提取物的活性成分及其促进细胞生长活性

赵玉红，马捷，李佳启，王路

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）（2.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨 150090）

老山芹（Heracleum moellendorffii Hance），又称为土当归、短毛白芷[1]和大叶芹等，学名东北牛防风，伞形科牛防风属多年生宿根草本植物，是黑龙江省林区常见山野菜种类之一，生长于我国东北和华北地区，朝鲜、俄罗斯等国河岸湿草地、草甸子、山坡林下及山地混杂林缘等阴湿环境[2]。老山芹是具有食用和药用保健价值的春季山林野生蔬菜，在山野菜品种中占重要地位。其嫩茎叶口味鲜美，富含胡萝卜素、维生素A、维生素C、维生素B2、维生素E、铁、钙、蛋白质和多种氨基酸等营养成分[3]及黄酮、香豆素、皂苷类化合物；全株可入药，具有祛风除湿、治疗腰膝酸痛、头痛及降血压等功效。高阳[4]等分析出老山芹根中亲脂性化学成分主要为长链醇、甾醇和香豆素类化合物。Zhang H L[5]等通过动物实验研究了老山芹甲醇提取物降血糖主要成分为香豆素类。

α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是影响饮食中淀粉等主要碳水化合物消化、吸收的关键酶，α-葡萄糖苷酶抑制剂可以有效防治餐后高血糖，用于治疗因碳水化合物代谢紊乱而引起的疾病[6]，α-淀粉酶抑制剂能有效抑制唾液淀粉酶和胰液淀粉酶活性，阻碍食物中碳水化合物的代谢，降低血糖和血脂水平[7]。

HepG2细胞是人肝癌细胞株，来源于人肝胚胎瘤细胞，与肝细胞表型相似，与正常的葡萄糖受体细胞相比，具有正常肝细胞的基本生理特征[8]，能够正常吸收葡萄糖，生成脂质，合成RNA，并且保持了糖原合成酶的活性[9]。Panc-1细胞是人胰腺癌细胞株，源自于胰腺癌导管细胞，胰腺是人体第二大消化道实性器官，也是重要的内分泌器官，胰腺具有分泌胰岛素的功能，胰岛素参与调节糖代谢，控制血糖平衡，可用于治疗糖尿病。

近年来，对老山芹的研究主要是生长发育方面，这种植物在细胞或动物中的药理活性研究较少，本实验以老山芹为原料，通过体外试验研究不同溶剂对老山芹活性物质含量及抗氧化活性，并比较不同溶剂老山芹提取物抗氧化能力及对HepG2和Panc-1细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜老山芹（Heracleum moellendorffii Hance）购于黑龙江嫩江农场；α-葡萄糖苷酶：上海源叶生物科技公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）：上海源叶生物科技有限公司；α-淀粉酶：上海源叶生物科技有限公司；人肝癌组织细胞系HepG2，人胰腺癌细胞系panc-1：黑龙江省哈尔滨医科大学惠赠；DMEM培养液：美国Hyclone公司；无支原体新生胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）：上海源叶生物科技公司；二甲基亚砜：天津市富宇精细化工有限公司；可溶性淀粉；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

ELx800NB型酶标仪：美国BioTek公司；电热恒温水浴锅 DK-S12：上海森信试验仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；pH计：Sartorius；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；CKX41倒置显微镜：OLYMPUS；二氧化碳培养箱：美国赛默飞世尔科技公司；超清工作台：YATAIKELONG；离心机：湖南星科科学仪器有限公司；25 cm2细胞培养瓶：美国Corning公司；96孔细胞培养板：美国Corning公司；手提式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；-80 ℃低温冰箱：美国赛默飞世尔科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 老山芹不同溶剂提取物的制备

水提物的制备：老山芹粉末在料液比1:60、提取温度80 ℃、提取时间3 h条件下进行提取，抽滤后，收集滤液，将滤液进行减压蒸馏，然后将提取物干制研磨成粉末待用。

酸提物的制备：老山芹粉末在提取温度70 ℃、料液比1:60、pH值3、提取时间2.5 h条件下进行提取，结束后，冷却至室温，抽虑分离，并减压蒸馏至原体积的一半，然后按3倍体积加入95%乙醇进行沉淀，静置30 min后有絮状沉淀析出；经离心、乙醇洗涤，将沉淀干制研磨成粉末待用。

碱提物的制备：老山芹粉末在提取温度60 ℃、料液比1:40、pH值12，提取时间2 h条件下进行提取，冷却至室温，抽滤分离，调节pH值至7.0，进行减压浓缩，然后按3倍体积加入95%乙醇进行沉淀，静置30 min后有絮状沉淀析出；经离心、乙醇洗涤，将沉淀干制研磨成粉末待用。

醇提物的制备：老山芹粉末在乙醇浓度80%、料液比1:15、提取温度50 ℃、提取时间2 h条件下进行提取，离心抽滤分离滤液，将滤液进行减压蒸馏，然后干制研磨成粉末待用。

1.3.2α-葡萄糖苷酶抑制率测定

α-葡萄糖苷酶抑制率参照[10～12]的方法，略加修改，取2 mg/mL的老山芹提取物100 μL，加入α-葡萄糖苷酶溶液50 μL，于37 ℃水浴10 min后，10 mg/mL的底物PNPG溶液50 μL，于37 ℃水浴15 min后，立即加入1 mol/L的Na2CO3溶液100 μL终止反应，用酶标仪在波长为405 nm处测定吸光值A1，另取100 μL磷酸盐缓冲溶液代替酶解液，测定其吸光值A0，再测定只有酶解液反应体系额吸光值A2，每组试验做5次平行。按式（1）计算抑制率。

1.3.3α-淀粉酶抑制率测定

α-淀粉酶抑制率参照[13,14]的方法，略加修改，取2 mg/mL 的老山芹提取物100 μL，加入50 μL 的α-淀粉酶溶液，于37 ℃水浴10 min后，加入1.0%的可溶性淀粉溶液50 μL，于37 ℃水浴5 min后，立即加入DNS溶液100 μL终止反应，再加入1000 μL PBS，用酶标仪在波长为540 nm处测定吸光值A1，另3取100 μL磷酸盐缓冲溶液代替酶解液，测定其吸光值A0，再测定只有酶解液反应体系额吸光值A2，每组试验做5次平行。按式（1）计算抑制率。

1.3.4 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法[15]，略加修改。取适宜浓度的老山芹提取物，加蒸馏水至2.0 mL，加1 mL 6%苯酚混匀，沿管壁加入5 mL浓硫酸，震荡混匀，静置20 min。以试剂空白调零，在490 nm波长处测定吸光度。

1.3.5 总酚含量测定

采用福林酚-肖卡法[16]，略加改动。取100 μL老山芹提取物置于10 mL容量瓶中，加水7 mL，摇匀，加入500 μL福林酚试剂，充分摇匀，1 min后加入20%Na2CO3溶液1.5 mL摇匀，最后加入900 μL蒸馏水，25 ℃恒温水浴避光反应1 h。在765 nm波长下测定吸光度。

1.3.6 黄酮含量测定

采用文献[16]的方法，略加改动。取500 μL老山芹提取物加入30%的乙醇至5 mL，加入300 μL 5%的亚硝酸钠，摇匀，6 min后加入300 μL 10%的硝酸铝，摇匀静置6 min后加入4 mL 1.0 mol/L的NaOH，反应15 min后，510 nm波长下测定吸光度。

1.3.7 ABTS自由基清除能力的测定

参考董竹平等[15]的方法略加改动。取不同梯度浓度稀释样品1.5 mL和ABTS溶液1.5 mL，加入同一试管中，混匀后室温下避光反应6 min，在734 nm下测定吸光值A1，空白A0以等体积蒸馏水代替ABTS溶液，对照组A2以等体积的蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水空白调零，清除率按式（2）计算，平行测定3次。

1.3.8 DPPH自由基清除能力的测定

参考文献[17]的方法，略加改动。取2.0 mL适宜浓度样品与2.0 mL 0.1 mmol/L DPPH混合，避光反应30 min，于517 nm波长测定吸光值A1。空白组用无水乙醇代替样品测定吸光值 A0，对照组用无水乙醇代替DPPH测定吸光值 A2，清除率按式（2）计算，平行测定3次。

1.3.9 FRAP总抗氧化能力测定

参考李昌勤等[18]的方法，略加修改。取20 μL样品加入96孔板中，加入180 μL FRAP工作液，混匀，在37 ℃水浴条件下反应5 min，于593 nm波长下测定吸光值。空白组以同体积蒸馏水代替样品，根据标准曲线计算总抗氧化能力。

1.3.10 细胞复苏、传代

在离心管中加入4 mL含有10% FBS的培养液，然后将HepG2和Panc-1细胞从液氮罐中迅速取出，放入37 ℃的温水的水浴锅中，使其融化至无冰碴。移入离心管中，吹打均匀后，离心机l000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入4 mL培养液，将细胞移入培养瓶中，放置到条件为37 ℃、5% CO2的二氧化碳培养箱中，按1:3比例进行传代[19]。

1.3.11 MTT试验

选取生长对数期的细胞经 0.25%胰蛋白酶进行消化后，用含10%新生牛血清DMEM培养液制成单细胞悬液，每孔按照5×104个细胞接种于96孔细胞板内，待细胞完全贴壁后，实验组以每孔100 μL分别加入1000 μg/mL、500 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL含药的培养液，每组复6孔，于37 ℃，5%CO2培养箱培养24 h后，按1:9体积每孔加入5 g/L MTT溶液继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），使结晶充分溶解，于酶标仪490 nm处测定吸光值，以吸光值反应细胞活性和数量的多少[20,21]。

1.3.12 数据处理

采用Origin 9.2制图，采用SPSS 20.0对数据进行方差分析、显著性检验，显著性水平设置p＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 老山芹不同溶剂提取物的 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率

图1是老山芹适宜条件下不同溶剂提取物的酶抑制率。由图1可得，适宜提取条件下α-淀粉酶抑制率最高的是碱提物，抑制率为 42.15%，最低为醇提物37.03%，水提物和酸提物α-淀粉酶抑制率依次是38.97%、37.71%；适宜条件下α-葡萄糖苷酶抑制率最高的是碱提物，抑制率为 67.78%，最低为醇提物43.51%，水提物和酸提物α-葡萄糖苷酶抑制率依次是55.38%、63.90%，由此可得pH对提取物的酶抑制率有较大影响。

图1 老山芹不同溶剂提取物酶抑制率Fig.1 The enzyme inhibition rate of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents

2.2 老山芹不同溶剂提取物对 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影响

图2 老山芹不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的影响Fig.2 Effects of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents on the inhibitory rates of α-glucosidase and α-amylase

图2是四种老山芹不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的影响。

由图2可知，老山芹不同溶剂提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均有抑制作用，随着提取物浓度的增大，对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用均呈增大趋势，当α-葡萄糖苷酶抑制率达到50%时，四种提取物浓度由大到小为水提物＞醇提物＞酸提物＞碱提物，其中碱提物IC50值为0.47 mg/mL，低于阳性对照阿卡波糖IC50值[22]；α-淀粉酶抑制率达到50%时，四种提取物浓度由大到小为酸提物＞水提物＞醇提物＞碱提物，其中碱提物IC50值为2.17 mg/mL，比很多中药提取物对α-淀粉酶抑制作用大[23]。碱提物对两种酶抑制率IC50值均最低。

由图1、2可得，适宜条件下碱提物的酶抑制率最大且碱提物酶抑制率IC50值最小，因此在四种提取物中碱提物降血糖效果最好。

2.3 老山芹不同溶剂提取物活性物质含量

图3 老山芹不同溶剂提取物活性物质含量Fig.3 The content of active ingredients in extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents

图3为老山芹不同溶剂提取物多糖、总酚、黄酮的含量。由图3可知，老山芹不同溶剂提取物中，多糖含量最高的是碱提物，为58.09 mg/g，含量最小的是酸提物，为51.48 mg/g，水提物和醇提物多糖含量依次为57.93 mg/g、57.42 mg/g；多酚含量最高的是醇提物，为11.48 mg/g，含量最小的是碱提物，为6.95 mg/g，水提物和酸提物多酚含量依次为10.76 mg/g、9.32 mg/g；黄酮含量最高的是醇提物，为3.96 mg/g，含量最小的是碱提物，为1.67 mg/g，水提物和酸提物黄酮含量依次为2.19 mg/g、2.03 mg/g。由此可得，醇提物中活性物质含量较高，酸提物中活性物质含量较少。

2.4 老山芹不同溶剂提取物抗氧化活性

老山芹不同溶剂提取物的DPPH法、ABTS法的IC50值和铁离子还原能力见表1。由表1可知，老山芹不同溶剂提取物中，以DPPH法为指标反应出抗氧化活性由大到小为醇提物＞水提物＞碱提物＞酸提物，以ABTS法为指标反应出抗氧化活性由大到小为醇提物＞水提物＞碱提物＞酸提物，以FRAP法FeSO4当量为指标反应出抗氧化活性由大到小为醇提物＞水提物＞碱提物＞酸提物，因此四种老山芹不同溶剂提取物中醇提物的抗氧化活性最高，李昌勤等[18]研究的中药女贞子相比，以DPPH法和ABTS法为指标，四种老山芹提取物IC50值均小于女贞子提取物，以FRAP法FeSO4当量为指标，醇提物FeSO4当量高于女贞子提取物，其他三种提取物略低于女贞子提取物，因此可得出醇提物抗氧化活性高于女贞子提取物，其他三种提取物抗氧化活性与女贞子提取物相当。由图3和表1可知，活性物质含量高的醇提物抗氧化活性也高，活性物质含量较少的酸提物抗氧化活性也较低。

表1 老山芹不同溶剂提取物抗氧化活性Table 1 The antioxidant activity of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents

2.5 老山芹不同溶剂提取物对 HepG2细胞存活率的影响

图4 老山芹不同溶剂提取物HepG2细胞存活率的影响Fig.4 Effects of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents on the survival rate of HepG2 cells

由图 4可知，用老山芹不同溶剂提取物处理HepG2细胞，随着浓度的增大，细胞存活率逐渐降低，低浓度1 μg/mL条件下，酸提物处理过的细胞存活率最高，细胞存活率为131.80%，碱提物处理过的细胞存活率最低，细胞存活率为 122.61%，醇提物和水提物细胞存活率依次为 135.35%、131.80%；在高浓度1000 μg/mL条件下，碱提物细胞存活率最高，细胞存活率为93.40%，乙醇提物细胞存活率最低，细胞存活率为 72.46%，酸提物和水提物细胞存活率依次为92.94%、84.77%，与Yang Gao等[24]研究的老山芹甲醇提取物相比，四种老山芹不同溶剂提取物在低浓度条件下均有促进HepG2细胞生长的作用。

2.6 老山芹不同溶剂提取物对 panc-1细胞存活率的影响

图5 老山芹不同溶剂提取物panc-1细胞存活率的影响Fig.5 Effects of extracts from Heracleum moellendorffii Hance by different solvents on the survival rate of panc-1 cells

由图 5可知，用老山芹不同溶剂提取物处理panc-1细胞，随着浓度的增大，细胞存活率均呈下降趋势，低浓度1 μg/mL条件下醇提物细胞存活率最高为111.94%，碱提物细胞存活率最低为96.11%，酸提物和水提物细胞存活率依次为103.53%、103.33%；高浓度1000 μg/mL条件下，酸提物细胞存活率最高为96.90%，水提物细胞存活率最低为76.43%，碱提物和醇提物细胞存活率依次为84.49%、81.45%，与Ding Xiaoge等[25]研究的三叶青提取物相比，三叶青提取物能显著地抑制panc-1细胞的生长，老山芹不同溶剂提取物在低浓度条件下可以促进panc-1细胞的生长，高浓度条件下才会抑制生长。

3 结论

通过对四种提取方法得到老山芹提取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率的比较可知，碱提物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用比其余三种提取物较显著，且碱提物对α-葡萄糖苷酶抑制作用比对α-淀粉酶抑制作用显著，因此，四种提取物中碱提物的降血糖效果最好。四种提取物中醇提物的活性物质含量较高且抗氧化活性较好，酸提物的活性物质含量较少且抗氧化活性较差。通过四种提取物对HepG2和panc-1细胞存活率的影响可知，随着提取物浓度增大细胞存活率均呈降低的趋势，四种提取物在低浓度1 μg/mL条件下均可促进HepG2和panc-1细胞生长，在高浓度1000 μg/mL条件下均抑制HepG2和panc-1细胞生长。