蘑菇中总甾体含量的测定

郭 华,刁全平,孙婷婷,侯冬岩

(鞍山师范学院 化学与生命科学学院,辽宁 鞍山 114007)

甾体类化合物是普遍存在于动植物中的天然产物，种类众多，数量庞大，几乎所有生物体自身都能合成.其生物活性广泛，具有抗炎、抗肿瘤、抗休克、增强免疫能力和应激反应等药理作用[1,2]，是一类重要的天然有机化合物，被称为“生命的钥匙”[3]，因此甾体类化合物的研究具有十分重要的意义.蘑菇中含有丰富的甾体类化合物[4],通过文献发现，对蘑菇活性成分的测定多集中在多糖、氨基酸、维生素上,而总甾体含量的测定鲜有报道.因此,本实验根据Liebermann-Burchard(LB)反应，采用紫外分光光度法，建立了蘑菇中总甾体含量的测定方法.

1 仪器、试药与试验材料

Cary 50 紫外分光光度计(美国Varian公司)；FA1204B电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；LFP-800T 高速多功能粉碎机(浙江省永康市红太阳机电有限公司)；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DK-98-II 水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司).

麦角甾醇对照品(中国药品生物制品检定所,批号111845-201604)；氢氧化钠、95%乙醇、乙酸酐、冰醋酸、石油醚、浓硫酸(均为分析纯,天津市光复精细化工研究所)；水为实验室自制蒸馏水.

本研究所用香菇、滑菇、杏鲍菇、真姬菇、杨树口蘑、松乳菇、棕灰口蘑、榛蘑，2016年购于或采于辽宁.样品阴干,实验前粉碎过0.25 mm筛备用.

2 方法与结果

2.1 显色剂的配制

LB反应中所用显色试剂为乙酸酐、浓硫酸和冰醋酸，体积比20∶1∶10.首先量取乙酸酐于容量瓶中，缓慢加入浓硫酸，摇匀冷却后加入冰醋酸，放置至室温即可.但要注意在低温的条件下配制显色剂，现用现配.

2.2 标准溶液的配制

精确称取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4 mg麦角甾醇对照品于圆底烧瓶中，分别吸取10 mL显色剂溶解，摇匀备用.

2.3 供试品溶液的配制

称取1 g蘑菇样品于圆底烧瓶中，在100 mL醇碱溶液(95%乙醇-20%氢氧化钠体积比40∶60)中热回流提取40 min，提取液回收乙醇后，冷却至室温，用等体积的石油醚(30～60 ℃)萃取3次，合并石油醚的萃取液，蒸干，加10 mL 显色剂溶解，摇匀备用.

2.4 测定波长的确定和标准曲线的绘制

图1 对照品和样品的吸收曲线

分别将配制好的标准溶液和供试品溶液在40 ℃水浴中加热20 min，冷却至室温后，于20～25 min内进行光谱扫描，显色剂为参比，扫描结果见图1.由图 1可知，在670 nm处麦角甾醇对照品和蘑菇样品均出现最大吸收峰，故以670 nm为最佳测定波长.以麦角甾醇对照品溶液浓度(C,mg/mL)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：A=4.116 7C-0.017 9，相关系数r=0.999 1，表明麦角甾醇在0.04～0.24 mg/mL范围内含量与吸光度有良好线性关系,测定数据见表1.

表1 麦角甾醇标准曲线数据

图2 吸光度在不同加热条件下随时间变化

2.5 稳定性试验

将配制好的标准溶液在40 ℃的水浴中分别加热0，10，20 min，取出，冷却至室温，在670 nm处每隔5 min测定吸光度，测定结果见图2，结果表明加热20 min后，在20～25 min内吸光度值比较稳定.

2.6 精密度试验

取配制好的对照品溶液于40 ℃水浴中加热20 min，冷却至室温，在20～25 min内重复测定5次，吸光度的RSD值为0.83%.

2.7 重复性试验

取相同样品，按2.3方法平行配制 6份，于40 ℃水浴中加热20 min，冷却至室温，在20～25 min期间内测定，计算RSD值为1.23%.

表2 不同蘑菇中总甾体的含量

2.8 回收率试验

取6份配制好的同一供试品溶液，分别加入一定量的麦角甾醇对照品，按上述测定方法测定，结果回收率平均值为101.78%，RSD值(n=6)为1.79%.

2.9 样品含量测定

按2.3样品处理方法，分别制备8种蘑菇的供试液(平行3份),40 ℃水浴中加热20 min，冷却至室温，在20～25 min内，于670 nm波长处测定吸光度，计算样品中总甾体的含量，结果见表2.

3 讨论

(1)甾体类化合物是一类结构特殊的天然产物，母体结构中含有环戊烷骈多氢菲碳骨架(图3)，大多缺少发色团和助色基，挥发性较差，不具备良好的高效液相色谱和气相色谱条件，其总含量测定有一定难度.本实验是根据甾体类化合物与LB试剂产生的特征性显色反应，采用分光光度法测定总甾体含量.

图3 甾体化合物的骨架结构

LB反应是Liebermann在1885年发现的，随后Burchard对该反应进行了改进，并把该反应推广到植物组织中甾醇的检测，即现在Liebermann-Burchard 显色反应[5].LB显色反应的主要原理是甾体类化合物在强酸的存在下，发生重排，形成发色基团而发生的反应[6].由于重排反应的发生具有一定连续性，甾体类物质与LB试剂反应不稳定，显色物质的颜色是逐渐变化的[7]，本实验中也发现对照品及供试品在反应中由淡绿逐渐变为棕黄色，因此，需探究显色反应的稳定区间.1952年，Kennyn对LB试剂与甾体类化合物反应进行了研究,结果发现在不同反应温度及时间下，产物的最大吸收波长没有变化，但是吸光强度随着反应时间的变化而改变[8],本实验也得到了验证：显色反应0,10,20 min后最大吸收波长都为640 nm，而吸光度不稳定(见图2)，从稳定性实验结果得出：40 ℃水浴中加热20 min，冷却至室温，在20～25 min内吸光度不变，为最佳检测时间.

(2)麦角甾醇是真菌类的特征甾体化合物[9],本文所测蘑菇样品前1～4种编号为人工种植，后5～8种编号为野生，经过TLC定性检测这8种蘑菇中都含有麦角甾醇，因此本实验采用麦角甾醇为对照品.

(3)本实验旨在对蘑菇中总甾体的含量测定方法进行研究.结果表明，麦角甾醇对照品和8种样品，与LB试剂显色反应吸收曲线相同，都在670 nm处产生最大吸收，40 ℃水浴中加热20 min，冷却后，在20～25 min内进行测定，具有较好的稳定性、精密度和准确性，适合用于人工种植和野生蘑菇中总甾醇的定量测定，同时为蘑菇质量评价提供参考.

[1] 郭瑞霞，李力更，王于方,等.天然药物化学史话：甾体化合物[J].中草药,2016，47(8)：1251-1264.

[2] 李静,周立刚,文成敬.真菌甾体化合物的研究进展[J].天然产物研究与开发,2008,20(1):165-171.

[3] 邱明华,聂瑞麟.生命的钥匙：甾族化合物[J].科学,1999，51(3):18-21.

[4] 刘吉开,胡琳,丁智慧,等.高等真菌次生代谢产物及其生物活性[J].中草药,2003，34(1)：84-86.

[5] Nath MC,Chakravorty MK,Chowdhury SR.Liebermann-Burchard reaction for steroids[J].Nat,1946,157(3978)：103-104.

[6] Burke RW,Diamondstone BI,Velapoldi RA,et al.Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak color reactions for cholesterol[J].Clin Chem,1974,20(7):794-801.

[7] Peakman TM,Ellis K,Maxwell JR.Acid-catalysed rearrangements of steroid alkenes.Part 2.A re-investigation of the backbone rearrangement of cholest-5-ene[J].J Chem Soc PerkinTrans,1988,1(5):1071-1075.

[8] Kenny AP.The determination of cholesterol by the Liebermann-Burchard reaction[J].Biochem,1952,52(4):611-619.

[9] 宋明杰,包海鹰.菌物中麦角甾类化合物的研究进展[J].菌物研究，2013,11(4)：266-274.