叶生小皮伞不同发酵产物中麦角甾醇和麦角甾酮的含量分析

娄玲，陈长宝，张岳，万茜淋，王欢，王淑敏

（长春中医药大学，吉林长春130117）

麦角甾醇和麦角甾酮是药用真菌中两大活性次生代谢产物之一，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种生物活性。麦角甾醇广泛存在于药用真菌子实体和发酵菌丝中，是真菌细胞膜的重要组分，也是真菌类的特征化合物[1]，以麦角甾醇为代表的甾醇类成分具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、免疫调节和降低胆固醇等多种药理作用[2-7]。研究已证实麦角甾酮具有利尿、治疗慢性肾脏病、抗癌、抗肿瘤和免疫抑制等多种生物活性[8-9]。

目前，国内对叶生小皮伞〔Marasmius epiphyllus（Pers.）Fr.〕的研究较少，主要集中在分类学[10]与不同发酵产物中多糖含量测定方面[11]，国外关于叶生小皮伞的发酵条件及发酵产物等相关研究鲜见报道。目前对其同属的药用真菌安络小皮伞的研究较多[12-13]，安络小皮伞相关药物制剂已上市多年，对于神经痛、偏头痛和风湿性关节炎等具有良好的效果[14]，因此叶生小皮伞具有一定的研究价值。借助娄玲等[15]对叶生小皮伞菌株ME-1的生物学特性以及液体发酵工艺的研究，本研究主要探究叶生小皮伞菌株ME-1的活性物质含量，丰富了叶生小皮伞的药用资源，对叶生小皮伞发酵产物中麦角甾醇和麦角甾酮含量进行测定，不仅可为叶生小皮伞质量控制提供科学依据，也可为其药用价值的研究与开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；I nertsil ODS-SP岛津C18色谱柱（4.6 250 mm，5m）（日本岛津公司）；HH6数显恒温水浴锅（常州市江南实验仪器厂）；AUY220万分之一分析天平（岛津国际贸易上海有限公司）；AU2450紫外分光光度计（岛津国际贸易上海有限公司）。

1.1.2 试剂甲醇（色谱级）（美国Fisher公司）；纯净水（娃哈哈集团有限公司）；麦角甾醇（批号：J26M6K1，纯度≥98%）、麦角甾酮（批号：X22M8L32255，纯度≥96%）（上海源叶生物科技有限公司）；其他试剂均为分析纯（北京化工厂）。

1.1.3 试材叶生小皮伞采于吉林省长春市净月潭国家森林公园，经长春中医药大学王淑敏教授鉴定为叶生小皮伞（Marasmius epiphyllus），并从中分离菌种ME-1，叶生小皮伞菌丝、发酵液是采用深层液体培养发酵得到；叶生小皮伞固体发酵产物为薏米麦麸固体培养基培养得到，于60℃烘干备用。

1.2 样品的制备

1.2.1 麦角甾醇对照品溶液的制备精密称取麦角甾醇对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得浓度为0.100 mg/mL的麦角甾醇对照品溶液。

1.2.2 麦角甾酮对照品溶液的制备精密称取麦角甾酮对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得浓度为0.123 mg/mL的对照品溶液，从中精密吸取1 mL对照品溶液加于另外10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，最终制得浓度为0.0123mg/mL的麦角甾酮对照品溶液。

1.2.3 供试样品溶液的制备称取干燥ME-1菌丝体3 g，干燥的固体发酵产物15 g，分别置于具塞的锥形瓶中，各加三氯甲烷50 mL，称重，超声30 min后，冷却，用甲醇补足失重，滤过，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，即得叶生小皮伞菌丝、固体发酵产物供试品溶液，用于麦角甾醇含量测定。称取ME-1菌丝体、固体发酵产物各10 g，分别置于具塞的锥形瓶中，加三氯甲烷50 mL，盖上塞子，称重，超声30 min，加甲醇补足失重，滤过，蒸干，将残渣用甲醇溶解并定容，菌丝定容至5 mL容量瓶中，固体发酵产物定容至10 mL容量瓶中，用于麦角甾酮含量测定。

1.3 色谱条件

色谱柱：Inertsil ODS-SP（4.6 mm 250 mm，5m）；流动相为甲醇，流速1.0 mL/min，进样量10L，检测波长282 nm，柱温30℃（此条件下检测麦角甾醇含量）；流动相为甲醇∶水=92∶8，流速1.0 mL/min，进样量10L，检测波长349 nm，柱温30℃（此条件下检测麦角甾酮含量）。

2 结果与分析

2.1 对照品和供试品分析

将麦角甾醇对照品溶液、麦角甾酮对照品溶液和供试样品溶液，分别按照“1.3”项下的色谱条件，利用高效液相色谱仪进行分析检测。结果显示，叶生小皮伞液体发酵菌丝体和固体发酵产物中均含有麦角甾醇和麦角甾酮。麦角甾醇对照品和麦角甾酮对照品色谱图如图1所示；供试样品色谱图如图2和图3所示。

图1麦角甾醇对照品（a）和麦角甾酮对照品（b）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of ergosterol reference substance（a）and ergosterone reference substance（b）

图2菌丝体（a）和固体发酵产物（b）中麦角甾醇的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of ergosterol in mycelium（a）and solid fermentation product（b）

2.2 方法学考察

2.2.1 线性关系考察 分别取麦角甾醇、麦角甾酮对照品溶液，依次进样1、2、4、8、10L，测定吸收峰面积，以麦角甾醇、麦角甾酮的进样质量和色谱峰面积分别作为横坐标、纵坐标绘制标准曲线，求得麦角甾醇和麦角甾酮的线性回归方程分别为Y=215 942 X 51 911（R2=0.999 8）和Y=28 058 X+2 779.8（R2=0.999 6），表明麦角甾醇和麦角甾酮分别在0.1~10.0和0.012 3~0.123 0g线性关系良好。

2.2.2 精密度试验取麦角甾醇、麦角甾酮对照品溶液，分别按“2.1”项下的方法测定，连续进样测定6次，每次进样10L，分别得到麦角甾醇和麦角甾酮的RSD分别为0.83%和0.55%，RSD均小于2.0%，表明该测量方法精密度良好。

2.2.3 稳定性试验取ME-1菌丝体和固体发酵产物供试品溶液，分别在配制后0、4、8、12、16、20、24 h进样分析，记录峰面积，并计算出供试峰面积的RSD，菌丝体和固体发酵物中的麦角甾醇峰面积RSD分别为1.39%和0.38%；麦角甾酮峰面积RSD分别为1.18%和1.76%，说明叶生小皮伞菌的菌丝体和固体发酵产物供试溶液中的麦角甾醇、麦角甾酮在24 h内稳定性均良好。

2.2.4 重复性试验将同一批ME-1液体发酵菌丝体和固体发酵产物分别进行精密称取6份，参照“1.2.3”方法进行制备，按照“1.3”项下的色谱条件进样，进样量为10L，计算得出发酵菌丝体和固体发酵物中麦角甾醇RSD分别为1.03%和1.77%，麦角甾酮RSD分别为1.39%和1.26%，表明该测量方法重复性良好。

2.2.5 加样回收率试验精密称取已知麦角甾醇含量的菌丝体样品3 g、固体发酵产物的粉末15 g，各6份，分别加入定量的麦角甾醇对照品精准，由表1~2可知，菌丝体的加样平均回收率为103.92%，RSD为1.80%；固体发酵产物的加样平均回收率为103.93%，RSD为1.22%，表明该测量方法回收率良好。

精密称取已知麦角甾酮含量的菌丝体、固体发酵产物粉末各10 g，每样6份，分别加入定量的麦角甾酮标准品。由表3~4可知，叶生小皮伞菌丝体的加样平均回收率为100.16%，RSD为1.45%；固体发酵产物的加样平均回收率为99.30%，RSD为1.82%，表明该测量方法回收率良好。

2.3 供试样品麦角甾醇和麦角甾酮含量测定

采用高效液相色谱法对叶生小皮伞菌菌丝体和固体发酵产物中的麦角甾醇和麦角甾酮进行含量测定，得出叶生小皮伞菌丝体中麦角甾醇的平均含量为125.0g/g，固体发酵物中麦角甾醇的平均含量为37.7g/g；菌丝体中麦角甾酮的平均含量为1.2g/g，固体发酵物中麦角甾酮的平均含量为4.8g/g。

表1菌丝体中麦角甾醇加样回收率试验结果Table 1 Results of recovery tests of ergosterol in mycelium

表2固体发酵物中麦角甾醇加样回收率试验结果Table 2 Results of recovery tests of ergosterol in solid fermentation products

表3菌丝体中麦角甾酮加样回收率试验结果Table 3 Results of recovery tests of ergotsterone in mycelium

表4固体发酵物中麦角甾醇加样回收率试验结果Table 4 Results of recovery tests of ergotsterone in solid fermentation products

3 讨论与结论

麦角甾醇为真菌类的特征甾醇，是脂溶性维生素D2的前体，具有多种生物学活性[9,16]。而转化物维生素D2可以作为饲料添加剂，能增加禽的产蛋率和孵化率。麦角甾醇也可以作为重要的医药化工原科，用于生产“可的松”和“激素黄体酮”等甾醇类药物[2]。研究表明，麦角甾酮有利尿、抗肿瘤和免疫抑制等多种生物活性。麦角甾醇和麦角甾酮是叶生小皮伞中2种主要的活性成分，存在于菌丝体与固体发酵物中。本研究利用发酵技术获得其菌丝体和固体发酵产物，发现麦角甾醇在菌丝体中的含量远高于固体发酵物中的含量，而麦角甾酮却在固体发酵物中的含量较高。这也说明同一菌株不同的发酵方式其次生代谢产物的含量也有明显不同。

本研究首次利用HPLC法测定并比较了叶生小皮伞发酵产物中麦角甾醇和麦角甾酮的含量，该方法较为稳定，准确性也较高。研究结果表明，叶生小皮伞ME-1菌丝体中麦角甾醇含量高于固体发酵产物，而固体发酵产物中麦角甾酮含量高于其菌丝体，这一发现为进一步对叶生小皮伞进行综合评价和质量控制提供了科学依据。