植物内生细菌来源及生物学功能研究进展

刘迎雪，赵滢，张宝香，杨义明，范书田，李昌禹，王月，许培磊，秦红艳，路文鹏

（中国农业科学院特产研究所，吉林 长春130112）

早在100多年前人们就发现了内生菌，但内生菌并不像病原菌一样使寄主植物表现症状。因此，长期以来对内生菌的研究一直被忽略，直到20世纪30年代，由于牲畜食用了感染内生真菌的牧草导致中毒，给畜牧业造成重大损失，对植物内生菌的研究才引起重视。大量研究发现，许多内生菌与植物互利共生，内生菌作为一种新的微生物资源受到了广泛的关注[1]。

内生菌一词“endophyte”最早于1866年由德国科学家Barry[2]提出，为了区别生长在植物表面的表生菌（epiphyte），将内生菌定义为在植物体内生活的微生物。在这100多年的时间里有多位科学家对内生菌的概念重新定义[3]。目前较公认的植物内生菌的概念为，在生活史的某一阶段或全部阶段，生活于健康植物的各种组织和器官内部的微生物，被侵染的寄主植物不表现出病症，可以通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生[4]。内生菌包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌。本文主要综述了植物内生细菌的来源及生物学功能研究进展情况。

每一种被研究的植物中都发现了内生细菌，它们在宿主植物的内部组织中定居，并能形成一系列不同的关系，包括共生、互利、共栖和营养共生[5]。大多数内生细菌似乎起源于根际或叶圈，然而，有些可能通过种子传播。内生细菌能促进植物的生长和提高植物的产量，并可作为生物调节剂。内生细菌还可以通过产生一系列的自然产物来提高宿主的抗逆性，这些天然产物在医药、农业或工业领域有潜在用途。为了更全面地了解内生细菌的来源和生物学功能，本文综述了近年文献，总结了内生细菌研究领域取得的成果，以期为北方特色抗寒浆果功能菌株的挖掘提供理论依据。

1 植物内生细菌的来源途径

植物是复杂的内生细菌群落的寄主，这些细菌在植物的地上和地下组织中均有分布。在植物组织内生活的细菌，每一代都可以从种子垂直迁移，也可以从环境中水平获得。了解内生细菌的传播途径和模式，将有利于农业和自然生态系统中植物-内生细菌相互作用的研究。

1.1 垂直传播

垂直传播即内生细菌从亲本到子代的垂直迁移，内生细菌在植物-内生细菌共生体中起着不可或缺的作用，例如广泛研究的细菌和昆虫之间的营养共生体[5]。目前研究较多的垂直传播方式包括种子迁移和花粉迁移。

1.1.1 种子垂直迁移种子微生物组越来越引起人们的兴趣。在已对表面消毒的各物种种子中都发现了细菌，包括植物玉米、大米、刀豆、南瓜和葡萄等[6-8]。在种子的不同部位，包括外壳、胚乳和胚组织中都检测到了细菌[9]。Truyens等[10]综述了种子内生细菌的研究，发现种子中的细菌往往属于特定的属，特别是芽孢杆菌（Bacillusanthracis）和假单胞菌（Pseudomonas），但也有类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、微球菌属（Micrococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、泛菌属（Pantoea）和不动杆菌属（Acinetobacter）。许多研究表明，一些种子内生细菌具有有益的寄主效应，例如在恶劣的环境条件下，种子内生细菌通过岩石风化和固定大气氮提供无机养分，可以促进植物萌发和生长[11]。考虑到这些有益的特性，可以推测，一些植物可能已经与细菌形成了共生关系，这种共生关系通过种子垂直传播，从而确保了有益共生关系的持续传播，类似于植物与内生

真菌之间的防御共生关系[12]。Miller等[13]描述的植物-细菌共生体证明了专性垂直传播。在被子植物紫金牛属（Ardisia）、大沙叶属（Pavetta）与九节属（Psychotria）等中存在的叶结球固氮伯克霍氏共生体存在于每一营养枝梢，并在每一片新叶上定殖，这些细菌还可以转移到花的生长点，随后进入发育胚珠的胚囊，然后到达胚珠的上胚轴，最终到达幼苗的茎尖。另外，Liu等[14]报道了特定内生细菌种在水稻和玉米中世代存在的连续性，这支持了垂直传播的观点。

1.1.2 花粉垂直传播内生菌进入种子的一种可能途径是通过雄配子。Frnkranz等[15]在不同植物种类的花粉内部发现了细菌。如果花粉内或花粉上的细菌起源于植物内部，它们向种子和幼苗的转移构成垂直传播。Ambika等[16]对从来源于地中海白松（Pinus halepensis）、意大利五针松（P.pinea）和土耳其松树（P.brutia）表面灭菌的花粉中分离到的内生肠杆菌属（Enterobacter）研究表明，所分离到的细菌是来自受精的胚珠，这种采用分离方式获得内生细菌证明了内生细菌是来源于花粉内部，表明松树花粉中的肠杆菌是通过垂直迁移的。

1.2 水平传播

1.2.1 土壤中的细菌通过种子际和根际进入植物定殖土壤被认为是内生细菌最重要的接种源[17]，是地下和地上植物微生物群落的库。种子际是土壤微生物定殖的开始部位之一，种子际微生物是围绕萌发种子的短暂的微生物动态区，在种子际细菌可以对萌发产生有益的影响[18]。种子以糖、蛋白质和脂肪酸的形式分泌出碳，这些化合物是微生物的能量来源，它们能改变种子周围土壤的细菌组成[19]。可能这种在植物早期通过选择形成的生物际间关系上所建立的互利作用是非常重要的[8]。根际（即围绕根部的毫米范围的土壤）充满了细菌，这些细菌可以促进宿主的生长发育，帮助获取营养，抵御病菌，诱导系统抗性，协助抵抗非生物胁迫，如有毒污染物或干旱[20]。根分泌物质吸引土壤微生物，增加植物根附近的微生物种群[21]。此外，植物根系通过影响土壤pH值、土壤结构和周围土壤的供氧量来调节其微生物群[22]。Philippot等[23]研究发现，植物在整个生命过程中，专门“招募”有助于适应压力的微生物。在几项研究中，细菌被定位在侧根出芽位置和根尖，这表明，细菌通过根部的裂缝和根尖进入[24]。Compant等[25]用带有绿色荧光蛋白（GFP）标记的Burkholderia sp.strain PsJN接种酿酒葡萄vinifera，PsJN从根表面开始，然后到根内部组织，最后在节间和叶片的木质部导管中发生了按时间顺序的定殖。以上研究都支持了细菌经过水平传播通过根定殖于植物内部的结论。

1.2.2 环境中的细菌通过叶片的气生组织和花器官进入植物定殖研究人员认为，叶际是地球上最普遍的微生物栖息地之一[26]。大气中有许多悬浮微生物，这些微生物是具有活性的[27]，悬浮微生物中的细菌尤其丰富，其浓度为104~106个细胞/m3[28]。悬浮微生物的形成被认为是细菌在全球和大陆尺度上扩散和迁移的主要机制[29]。特别是空气中的尘埃，被认为是微生物的主要运输方式[30]。病原菌通过植物的气孔进入的途径已被研究，而内生细菌通过植物的气孔进入途径的研究报道较少。对病原菌的研究表明，病原菌可以通过气孔、皮孔和水孔进入植物的叶片和茎，但气孔数量最多，是进入植物地上部分内部的主要途径[31]。事实上，植物识别并排斥特定的细菌进入它们的气孔，而这些细菌发展出了对抗这些反应的机制，这就提出了一个问题：是否允许共生菌或有益的叶际菌进入气孔，并可能将其作为内生菌在地上部分进行定殖。对叶片表面和内部群落组成菌的重叠研究表明，叶片表面菌落代表了某些叶片内生菌定殖的初始阶段[32]。对菠萝的内生细菌进入途径进行研究发现，固氮内生细菌Herbaspirillum seropedicae可以进入菠萝的气孔中，细菌聚集在毛状体、表皮细胞壁交界处和气孔复合体附近，然后通过气孔下腔进入叶肉细胞间隙[33]。

以上研究证明了大气中的细菌从叶片、茎进入植物组织成为内生细菌，但也有研究表明，植物内生细菌也可以通过植物组织迁移到植物表面，进入大气中。Lindemann等[34]对大气中存活细菌的定量研究发现，植物冠层上的细菌浓度远远高于土壤中的细菌浓度，这项研究表明，植物冠层是空气传播细菌的主要来源。Bowers等[35]对农田、郊区和森林上空空气传播菌群的描述指出，土壤和植物表面是近地表大气中部分细菌的来源。还有研究表明，种子传播的细菌通过发芽的幼苗接种到植物表面[36]。

除了气生组织，细菌进入植物的另一个途径是花器官。在花器官的表面寄生着不同的细菌群落[37]。通过分离培养的方法已经描述了花粉、花蜜、花瓣、雌蕊、果实中的细菌[38]。通过研究证明，花表面的细菌和叶表面的细菌来源相同，都是来自于大气、悬浮颗粒、风、雨的飞溅、传粉昆虫[39]。在对苹果花相关微生物群落的研究结果认为，风可能是细菌传递到花的媒介[40]。关于细菌通过环境在花中定殖还未有直接证据，但通过梨火疫病病原体（Erwinia amylovora）感染苹果花，穿透花组织的研究[41]可以间接说明，细菌是可以通过花器官进入植物的。

2 内生细菌的生物学功能

2.1 促进宿主植物生长

内生细菌对植物生长的促进作用主要是通过产生赤霉素、生长素、细胞分裂素等植物激素，直接促进植物生长；通过菌株的固氮、溶磷作用[42]、铁素体的产生[43]等，间接促进植物生长；通过诱导植物产生耐受物质，提高植物的抗逆性从而促进植物的正常生长。

2.1.1 内生细菌的固氮、溶磷作用氮是植物生长发育所必需的大量元素之一，氮的使用在很大程度上决定了植物的产量。近年来，为满足不同作物对氮素的需求，植物内生细菌固氮已成为提高作物产量的一个重要途径。固氮作用涉及宿主植物的适应性，特别是在缺氧环境下的适应性[44]。植物通过固氮获得养分，固氮是菌株促进植物生长的一种机制[45]。这一特征在根瘤菌中得到了很好的验证，目前发现了许多有固氮功能的菌株，如芽孢杆菌属（Bacillus）、草螺菌属（Herbaspirillum）、固氮螺菌属（Azospirillum）及产碱菌属（Alcaligenes）等[46]。

利用溶磷微生物作为单一肥料或与其他生物肥料混合施用，可提高作物对养分的准确吸收，减少磷肥的过量施用。研究表明，不同的细菌种类，特别是根际定殖细菌，具有产生葡萄糖酸、溶解不溶性磷酸盐和促进植物生长的能力[47]。内生细菌将可溶性磷酸盐提供给植物，作为交换，它们主要从植物根部获取细菌生长所必需的糖和有机酸。研究表明，给农作物接种溶磷微生物，在不显著降低作物产量的情况下，磷肥施用量可降低50%[48]。

2.1.2 内生细菌通过产生植物生长调节物质促进植物生长促进植物生长的内生细菌通过产生刺激植物生长的化学物质来发挥它的功能。这些化学物质包括赤霉素、生长素、细胞分裂素和挥发类化学物质。目前证明假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、固氮菌属（Azotobacter）、肠杆菌属（Enterobacter）和固氮螺菌属（Azospirillum）等属的一些菌株可以产生乙烯、生长素和细胞分裂素，并通过这些生长调节物质来改变植物的生长发育[49]。Egamberdieva[50]研究发现，在盐或干旱胁迫下，细菌产生的生长素对植物的促生效应依赖于生长素浓度，且不同的植物对生长素浓度效应也不一样；除了细菌生长素的数量外，生长素对植物发育的促进作用还与宿主本身的敏感性有关。产生长素菌株对小麦[51]、黑醋栗和酸樱桃[52]的影响研究证明了植物对细菌反应的品种特异性。Persello-Cartieaux等[53]研究发现，拟南芥的生长素抗性突变体对硫维菌根定殖不敏感，而同样的接种在野生型植物上会引起根系形态的变化。寄主植物还可以积极参与调控微生物生长素的生物合成。科学家们不但证实了内生细菌产生促生长物质，还明确了其作用途径，经过研究发现大多数有益内生细菌通过吲哚丙酮酸（IPyA）途径产生生长素，且这一观点认为，吲哚-3-乙酰胺（IAM）途径与发病机制有关，这一观点通过Pa突变体的产生得到了支持[54]。Lpez-Bucio等[55]对根际细菌进行研究发现菌株Bacillus megatarium UMCV1可以产生细胞分裂素，该细菌通过抑制主根生长、增加侧根形成和根毛长度来促进植物生长。

2.2 增强宿主植物抗逆性

内生细菌能通过产生次生代谢物质而增强植物的抗逆性，这引起了越来越多研究者的重视。Chen等[56]将接种内生细菌的棉花再接种棉花枯萎病菌，发现接种了内生细菌的棉花感病症状明显比不接种的植株症状减轻。王万能等[57]从烟草根茎部分离所得的118菌株对烟草有诱导抗病作用，防治烟草黑胫病效果很好。目前很多有益菌株已被开发成植物生防菌剂[58]。对内生细菌的研究虽然有很多，但关于内生细菌与宿主植物的互作机制并没有完全明确，原因是内生细菌与植物的互作关系十分复杂，而且内生细菌长期生活在植物体内，生存环境稳定，在研究过程中很难模拟这种环境模型，而在活体植物上直接开展研究又很难实现。总结近些年关于内生细菌提高植物抗逆性的研究结果包括以下几方面。

2.2.1 分泌抗菌物质目前研究的内生细菌产生的抗菌物质主要是抗生素，抗生素是一种低浓度即能杀死病菌的异源小分子化合物。植物内生细菌产生的抗生素类物质主要有藤黄绿脓菌素（Plt）、2，4-二乙酰间苯三酚（2，4-DAPG）、硝吡咯菌素（PRN）和吩嗪-1-羧酸（PCA）等。2，4-二乙酰间苯三酚是假单胞菌属（Pseudomonas）产生的一种酚类化合物，它具有抗病毒、抗病原真菌及其它细菌的作用[59]。Beck等[60]从小麦体内获得的一株粘质沙雷菌（Serratia marcescens）能够产生Fusaricidin A-D抗菌活性物质，这种物质提高了小麦的抗病性。Diby等[61]研究发现，植物内生细菌产生的氰化氢可抑制辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsicii）的生长。Mohamed等[62]研究细菌菌株GB03和IN937a对植物的抗逆性作用发现，菌株是通过产生挥发性有机化合物（VOC）来激发植物的防御反应，同时，内生细菌通过释放2，3-丁酮、3-羟基丁酮等易挥发性有机化合物来诱导植物产生系统抗性。

2.2.2 与病原菌竞争生态位和营养物质近些年的研究发现内生细菌侵入寄主的途径、方式等与病原菌相似，有些内生细菌进入植物后优先占据了病原菌的侵入位点，竞争了生态位，导致病原菌无法进入植物体内。例如，Bacon等[63]研究玉米内生细菌发现，内生枯草芽孢杆菌与病原菌串珠链孢菌（Fusarium moniliforme Sheldon）有相同的生态位点，该菌能在玉米内迅速定殖和繁殖，有效降低了病原菌串珠链孢菌的侵入及其毒素的积累。

2.2.3 诱导宿主植物产生系统抗性（induced systemic resistance，ISR）除了直接互作而引起的生防作用外，植物内生细菌还可以诱导寄生植物产生系统抗性（ISR）来抑制病原菌的侵袭和生长。一些内生细菌能诱导植物在细胞间隙积累酚类、醌类物质，从而构成植物体内机械和化学屏障，阻止病菌的侵入。Van Peer等[64]通过研究证实了内生菌诱导植物产生的系统抗性是通过结构方面的改变产生的，而与病程相关蛋白无关。Benhamon等[65]将内生细菌Bacillus pumilus strain接种豌豆然后再接种病菌，结果在病菌的侵入点发现了大量沉积的鞣质和酚类物质，细胞壁加厚，病菌被限制在外皮层和木栓层之间不能进入。这些都充分证明了内生细菌能够通过诱导植物组织结构的改变，阻止病菌的侵入，从而提高植物抗性。

2.3 生物修复作用

肥料和含重金属的化学农药长期与大量施用，导致不能分解物质大量残留，不仅污染环境，而且导致农产品重金属离子和农药残留超标。从植物体内分离获得对农药、化肥和重金属具有降解作用的内生细菌，因其具有能在植物体内定殖的特点，对降解农产品内农药、肥料、重金属的残留具有更大的优势。目前利用内生细菌对土壤中农药残留和化肥降解方面的研究报道很多，如假单胞菌可以降解土壤中残留的除草剂阿特拉津[66]；枯草芽孢杆菌可以分解土壤中难溶的磷酸盐，使之容易被植物吸收[67]。Germaine等[68]从杨树中分离到的内生细菌POPHV6（P.putida strain）可以降解土壤中的除草剂2，4-二氯苯氧基乙酸，从而增加植物的修复能力。Van等[69]从杨树中分离到的内生细菌BJ001（Methylobacterium populi）和Bu61（B.cepacia）分别能降解甲烷和甲苯。

2.4 产生有价值的代谢产物

植物产生的生物活性化合物具有很强的生理活性。然而，它们的生产也存在着各种各样的问题，例如植物生长慢、有效成分低等生产力水平下降的问题。内生细菌在受控的环境条件下产生初级和次级代谢物，可以保证活性化合物均匀、高质量及最大效率的生产[70]。大量研究发现利用植物内生细菌可以生产有较高药用潜力的材料。内生细菌合成的次生代谢物和酶等生物活性化合物被广泛用于食品和食品补充剂、生物燃料、生物农药等一些产品的制造中[71]。植物内生细菌可产生丰富多样的具有生物活性的代谢产物，按其功能主要分为抗生素类、抗肿瘤物质和杀虫剂类等。

2.4.1 产生抗生素抗生素是微生物作为次生代谢产物产生的天然化合物，可以杀灭或抑制其他微生物。自1928年Alexander Fleming发现第1例抗生素（青霉素）至今，人们对抗生素的研究和利用已经超过近百年的历史，它们在20世纪传染病治疗中发挥了重要作用。到目前为止，制药工业主要针对的是来自土壤微生物、细菌或真菌的药物。而细菌、放线菌尤其值得注意，因为它们是产生抗生素的主要来源，80%的抗生素来源于链霉菌[72]。从链霉菌分离物中至少发现了7 000种不同的次生代谢物[73]。大多数内生细菌可产生不同种类的抗生素。Ecomycin、Pseudomycins和Kakadumycins是内生菌产生的一些新型抗生素[74]。黄褐假单胞菌是许多禾本科植物叶子上的附生或内生菌，它产生的氯霉素可用于治疗呼吸道和尿道感染，皮肤、眼睛和肠道感染。研究人员从木犀草内生链霉菌中分离出一种新的萘醌类抗生素阿齐霉素；从蛇藤中分离的内生菌NRRL30562产生了新的绿藻螺旋霉素，其对多种人类疾病、植物病原真菌和细菌具有广谱活性；NRRL30566是从一株蕨叶银桦（Grevillea pteridifolia）叶片中分离得到的内生链霉菌，其化学性质与棘霉素类似[75]。2.4.2产生抗菌化合物内生细菌产生的抗菌代谢产物是具有生物活性的天然化合物[76]。内生细菌已经形成了一种通过产生次生代谢物来控制病原入侵的抗性机制[77]。许多内生细菌产生的抗菌化合物属于多个结构类别，如多肽、生物碱、类固醇、奎宁、萜类、酚类和黄酮类[78]。Zhao等[79]从攀西高原的26种药用植物中分离到大量的内生放线菌，其抗菌谱极广，是新型生物活性化合物的重要来源。Hong-Thao等[80]从柑橘果实中分离得到的内生链霉菌TQR12-4具有抑菌活性，抑制了试验病原菌毛豆炭疽病（Colletotrichum truncatum）、白地霉菌（Geotrichum candidum）、黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）的生长。

2.4.3 产生抗肿瘤物质自从1993年Stierle等[81]首次从太平洋红豆杉中分离出1株产紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae以来，从内生细菌中分离提取高效抗癌活性物质成为了科学家们研究的热点，他们投入了大量的精力和物力来开展这方面的研究，并取得了一些重大的进展。一些内生细菌产生的生物活性化合物已被确定为抗癌剂[82]。Jung等[83]从红辣椒叶片中分离到内生细菌EML-CAP3，该菌株具有较强的抗血管生成活性；该菌株产生亲脂肽，抑制人脐静脉内皮细胞的增殖，并在肿瘤进展中表现出抗血管生成的潜力。众所周知，人参以其具有抗癌特性的人参皂苷而闻名。Gao等[84]将从人参中分离的内生细菌进行回接，发现能促进人参皂苷的产量。Chen等[85]通过研究首次发现，芽孢杆菌是抗肿瘤胞外多糖的来源，作为一种新的抗癌剂，它是一种具有很高治疗价值的天然产物。

3 结语与展望

随着对内生细菌研究的不断深入，利用其独特的生物活性物质合成特性的潜力也日益增大。目前，对北方药用植物如人参、五味子和刺五加等内生细菌的研究不多，在特色浆果山葡萄、软枣猕猴桃和蓝靛果等方面内生细菌的研究更是鲜有报道。细菌内生菌可以为寄主植物提供多种益处，尤其是促进生长和保护寄主植物免受病原体的侵害[86]。生长在北方的植物，其生长环境寒冷、干燥，尤其是野生株生长的环境更为恶劣，其内部的微生态系统对植株生长起着重要的作用。未来可对北方特色药用植物和浆果内生细菌进行深入研究，挖掘功能菌株，开发生物农药、肥料及生物活性化合物，这对特色产业的发展具有重要的意义。