有氧运动调控MAPK信号通路对于急性心肌缺血大鼠的作用

龚彦豪，黄宝叶，杨新林，韦雪亮

(1.桂林电子科技大学体育部，广西桂林 541004；2.西北农林科技大学体育部，陕西杨凌 712100；3.广西大学体育学院，广西南宁 530004)

适度运动可有效改善心脏功能，但长时间高强度的力竭运动则起反作用，易诱导心脏一系列病理改变[1]。其关键机制在于力竭运动可造成心肌缺血缺氧，从而易造成心脏、肾脏等脏器损伤[2]。近年来，亚健康背景下的人群，在运动过程中其心脏性病变发生率极高，运动性猝死日益常见[3]。因此，力竭性运动诱导的心脏损伤相关问题成为关注焦点。

MAPK家族作为生物体内重要信号转导系统之一，MAPK相关信号通路功能日益凸显[4-5]。目前针对MAPK相关信号通路在心肌缺血以及再灌注损伤中的研究颇多，既往研究亦证实MAPK通路相关蛋白在促进心肌细胞凋亡上的重要角色，以及相关抑制剂在促进缺血再灌注损伤中心脏功能恢复的重要作用[6-8]。但现阶段，有关MAPK相关信号通路在力竭心脏中的研究比较少见，因而研究该通路对于进一步阐明力竭心脏的生理病理机制和探索防治措施具有重要临床意义。本研究通过建立大鼠心肌缺血损伤模型，观察有氧运动在损伤心脏中扮演的角色，并进一步检测MAPK信号通路相关蛋白表达变化，以期探讨有氧运动发挥作用的可能途径与机制，为心血管疾病防治提供相关理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，鼠龄8周～10周，体重20 g～30 g，广西医科大学动物研究所提供。大鼠试验前接受常规单笼喂养，自由饮食，温度在22℃～25℃之间，相对湿度40%～50%，光照周期为12 h以模拟正常的昼夜生理规律。3个组大鼠每天均接受普通饲料喂饲160 只。

1.2 方法

1.2.1 分组及模型构建 试验分组：将经过适应性喂养的30只大鼠参照随机数字表随机分成3个组，对照组、急性力竭组、有氧运动组，每组大鼠10只。对照组无运动处理；急性力竭组采用尾部负重的方式进行力竭性游泳运动，其急性力竭运动至力竭状态参考Thomas力竭标准；有氧运动组采用无负重(有氧)游泳训练。急性力竭组和有氧运动组大鼠游泳训练每天1次，持续14 d。

心脏缺血/再灌注损伤模型的建立：应用15 g/L戊巴比妥钠麻醉。固定大鼠进行气管插管。胸前区去毛，碘伏消毒。纵行切开胸骨左缘第3～4肋间处皮肤，钝性分离胸大肌、前锯肌和胸小肌，剪断2～3肋骨及助间肌，心包，暴露心脏，用4/0线在冠状动脉前降支根部系结，其间穿过一根塑料管将结拉紧，胸腔关闭。结扎大鼠心脏冠状动脉前降支根部30 min后，拔出塑料管，使冠状动脉恢复血流灌注；于冠状动脉血流再通120 min时处死大鼠，立即取大鼠心脏，供下一步试验。

1.2.2 血清标本 使用真空采血管采集所有实验动物经腹腔静脉血约6 mL，注入不含抗凝剂的试管中，标本静置后10 000 r/min离心20 min分离血清，留取上清，分装置于-80℃冰箱保存。同时，去除实验动物心脏后，PBS清洗残留血渍，液氮冰冻，随后置于-80℃冰箱保存。

1.2.3 Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白水平 使用Western blot法检测ERK和p38蛋白表达。提取细胞总蛋白后根据BCA蛋白定量试剂盒说明书制作标准曲线，测蛋白含量，计算含 40 μg蛋白的溶液体积即为上样量，100 g/L SDS-PAGE凝胶电泳，转移至直径为0.22 μm的PVDF膜，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，10 g/L脱脂牛奶稀释孵育一抗(1∶500)4℃过夜，TBST 洗膜，稀释孵育二抗37℃静置1 h(1∶1 000)，显影。

1.2.4 血清学检测 基于生物素双抗体夹心技术原理，参照酶联免疫试剂盒说明书，对血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)含量进行检测。提取蛋白，4℃预冷，将心脏标本剪至细小碎片，加入抽提试剂，裂解30 min，随后10 000 r/min离心5 min，吸取上清，置-20℃保存。按试剂盒说明书稀释标准品、加样、显色，随后加终止液，在波长450 nm处测量各孔吸光度(OD值)。

2 结果

2.1 各组大鼠观察状况

对照组大鼠日常活动自如。有氧运动组大鼠在有氧运动后，其日常活动无明显异常、灵活自如，皮毛光亮。急性力竭组大鼠在力竭运动后出现如下表现：四肢活动不协调、站立不稳，伴随呼吸急促及四肢瘫软表现。

2.2 血清学指标含量变化

通过对血清CK含量的检测发现，对照组大鼠血清CK含量为10.23±1.22，急性力竭组运动后大鼠血清CK含量为15.78±1.54，而有氧运动组运动后大鼠血清CK含量为12.59±1.30。统计分析提示，与对照组相比，急性力竭组大鼠CK血清含量显著升高，有氧运动组血清含量亦出现上升趋势，差异有统计学意义 (P<0.05)。同时，有氧运动组与急性力竭组相比，血清CK含量呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。

同时，对血清LDH含量的检测发现，对照组大鼠血清LDH含量为3.69±0.70，急性力竭组和有氧运动组运动后大鼠血清LDH含量分别为4.60±0.83和4.00±0.64。统计分析显示，与对照组相比，急性力竭组大鼠LDH血清含量明显提高，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，有氧运动组与急性力竭组相比，血清LDH含量下降，存在统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 血清肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)血清含量变化情况

注：*与对照组相比，P<0.05;#与力竭运动组相比，P<0.05。

Note:*compared with the control group,P<0.05;#compared with the acute exhaustive group,P<0.05.

2.3 Western blot检测结果

通过大鼠心肌组织的Western blot检测发现，对照组大鼠心肌组织ERK表达水平为0.211±0.06，急性力竭组大鼠心肌组织ERK表达水平为0.786±0.08，而有氧运动组运动后大鼠ERK表达水平为0.340±0.05。与对照组相比，急性力竭组大鼠心肌组织ERK表达水平显著升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。同时，有氧运动组与急性力竭组相比，心肌组织ERK表达水平呈下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)。

对照组大鼠心肌组织p38表达水平为0.460±0.05，急性力竭组大鼠心肌组织p38表达水平为0.902±0.07，而有氧运动组大鼠p38表达水平为0.452±0.05。与对照组相比，急性力竭组大鼠心肌组织p38表达水平显著升高，存在统计学差异(P<0.05)。同时，相比急性力竭组，有氧运动组心肌组织p38表达水平呈下降趋势，差异具有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 Western blot检测ERK和P38表达水平情况

注：*与对照组相比，P<0.05;#与力竭运动组相比，P<0.05。

Note:*compared with the control group,P<0.05;#compared with the acute exhaustive group,P<0.05.

3 讨论

众所周知，过度运动超过机体本身的负荷，极易造成运动相关损伤，如骨骼肌肉损伤、心脏损伤，以及肾脏损伤等[9]。过度运动性损伤在训练场等尤为普遍，同时，心脏相关的损伤近年来有明显增高的趋势[10-11]；心脏损伤主要表现为心功能受损、结构性损伤以及生理性改变等[12]。现阶段，针对过度运动造成的心脏损伤机制暂未完全阐明。因此，本研究从力竭运动诱发的心肌损伤切入，探讨有氧运动调控MAPK信号通路对于急性心肌缺血大鼠的作用及其相关机制。

首先，就缺氧在心肌细胞损伤中扮演的角色而言，长时间高强度的力竭运动，势必增加心肌耗氧水平，缺氧时细胞内ATP生成不足，导致无氧代谢增强，进而诱发心肌损伤[13]。就心肌损伤标志物而言，LDH主要存在于心肌、骨骼肌等[14]。正常情况下，细胞膜的完整性和工能的正常性确保了CK和LDH等渗透出细胞膜，因此，血清中的CK和LDH含量可以作为评价运动强度的关键性指标[15]。另外，MAPK信号转导通路是一复杂而又功能庞大的信号转导网络载体，调节众多复杂生物体功能，涉及细胞生长、分化、凋亡等各个阶段[16]。哺乳动物中MAPK信号转导通路包含5个亚家族，ERK通路是研究较广泛的一类[17]。在各种因素(如电离辐射、再灌注、压力负荷等)作用下，未激活的ERK一旦受刺激，将从细胞浆迅速穿越核膜，进而激活其偶联的转录因子，进而调节相关靶向基因的转录，从而实现调节细胞产生生物学效应。既往研究已证实ERK在细胞进程中发挥关键性调节作用。与此同时，p38亦可被缺氧、再灌注、紫外线、氧化应激、热休克等各种刺激激活，从而参与细胞凋亡等进程。

本研究结果显示，力竭运动对大鼠造成明显损伤，体现在四肢活动不协调、站立不稳，伴随呼吸急促及四肢瘫软表现；而接受有氧运动的大鼠日常活动和机体未出现明显异常，初步提示相比力竭运动，有氧运动在减轻机体细胞损伤上的作用。活性氧是一种细胞应激刺激，研究发现其可通过ERK和p38等介导细胞进程。本研究进一步探究潜在机制，发现相比力竭运动组，有氧运动组大鼠CK和LDH血清含量降低，提示有氧运动可维持胞膜的结构稳定及完整性，以及改善机体供氧能力，从而减轻氧自由基对心肌造成的损伤，从而达到避免类似于力竭运动过程中的心脏损伤后果，对心肌具有保护作用。此外，本研究采用Western blot进一步发现力竭运动可激活大鼠心肌组织ERK和p38表达，究其原因可能与氧自由基生成增加相关；而有氧运动组ERK和p38表达水平较力竭运动组低，提示有氧运动对心脏保护的作用，可延缓或减轻应激刺激对心肌细胞造成的影响。

本研究发现力竭运动可造成机体缺氧、氧自由基增多、胞膜稳定性破坏，从而影响心肌细胞损伤；有氧运动可在一定程度上抑制氧自由基产生，阻断MAPK信号通路的转导。本研究从分子生物学角度探讨了有氧运动抗心肌损伤的机制，可为探讨力竭运动对心肌损伤的作用机制提供论依据。

参考文献：

[1] 张 昊,王伟伟,薛 过,等.运动训练通过诱导自噬、抑制凋亡改善老龄大鼠心脏功能[J].中国病理生理杂志,2014,30(1):11-17.

[2] Salazar A P,Quagliotto E,Alves J,et al.Effect of prior exercise training and myocardial infarction-induced heart failure on the neuronal and glial densities and the GFAP-immunoreactivity in the posterodorsal medial amygdala of rats[J].Histol Histopathol,2014,29(11):1423-35.

[3] Peng R X,Miao W L,Zhou S J.Chaotic medicine,homeostasis and sudden death[J].J Clin Rehabil Tissue Engin Res,2008,12(15):2956-2960.

[4] 盛晓赟,夏亚一.MAPK家族ERK5信号通路的研究进展[J].医学综述,2012,18(19):3145-3147.

[5] Liu M,Chen J,Huang Y,et al.Triptolide alleviates isoprenaline-induced cardiac remodeling in rats via TGF-β1/Smad3 and p38 MAPK signaling pathway[J].Die Pharmazie,2015,70(4):244-250.

[6] 杨 婉,金世云,许士进,等.p38MAPK信号通路在吗啡预处理减轻心力衰竭大鼠心肌缺血再灌注损伤中的作用:离体实验[J].中华麻醉学杂志,2016,36(6):673-677.

[7] Gao Y,Le K,Li C,et al.Resveratrol ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction through AT1R-ERK/p38 MAPK signaling pathway[J].Cardiovas Toxicol,2016,16(2):130-137.

[8] Zhao J.X indening oral liquid improves cardiac function of rats with chronic cardiac failure via TGF-b1/Smad3 and p38 MAPK pathway:[J].Anatolian J Cardiol,2017,17(5):367-373.

[9] 董玉福.学生运动性猝死频发的原因及预防对策探析[J].大理学院学报,2013,12(3):26-30.

[10] Patil HR,O'Keefe JH,Lavie CJ,et al.Cardiovascular damage resulting from chronic excessive endurance exercise.[J].Missouri Med,2016,109(4):312-321.

[11] 俞向梅,张文光.中药疗法对过度运动训练后心肌损伤影响的实验研究进展[J].现代中西医结合杂志,2010,19(13):1674-1675.

[12] 乔钰惠,朱宝玲,李子健.性别对大鼠急性心肌损伤后心脏结构与功能的影响[J].中国心血管杂志,2017,22(2):134-139.

[13] Gao H,Wu H,Zhao H.Effect of rosemary on myocardium free radical metabolism and serum enzyme after exhaustive exercise[J].Adv J Food Sci Technol,2015,7(12):940-942.

[14] Nazhvani F D.Experimental coronary veins obstruction in sheep:Changes in serum enzymes[J].J Animal Sci,2012,2(8):686-690.

[15] 梁 健,李焕春.预热处理对离心运动大鼠骨骼肌超微结构、血清CK、LDH及氧化应激的影响[J].中国应用生理学杂志,2017,33(2):102-104.

[16] Sun Y,Liu W Z,Liu T,et al.Signaling pathway of MAPK/ERK in cell proliferation,differentiation,migration,senescence and apoptosis.[J].J Receptor Signal Transd Res,2015,35(6):600-604.

[17] Lee C T,Tyan S W,Ma Y L,et al.Serum-and glucocorticoid-inducible kinase (SGK) is a target of the MAPK/ERK signaling pathway that mediates memory formation in rats[J].Eur J Neurosci,2010,23(5):1311-1320.