干细胞分泌因子对皮肤创伤犬的治疗作用

蒋 桃，卫朝辉，蒲 辉，张 檬，曾梦颖，张 迪，高 洪，严玉霖

(云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201)

皮肤作为机体最大的组织器官及第一道防线，具有重要的生理功能。外伤、烧伤、肿瘤切除手术等临床上各种常见原因均能导致其损伤。其中促进创面修复是治疗皮肤损伤的重要环节，及时封闭创面可减少组织液渗出、预防细菌血流感染、防止脓毒血症发生和减少发生器官并发症，还可防治瘢痕的过度增生，降低对生命的威胁、减轻痛苦[1]。创伤修复也成为医学领域的研究焦点，其一般分为三个相互重叠的阶段，即炎性反应期-增生期-重塑期[2-3]，每个阶段都具有重要意义。因此，如何发现新的、有效的修复皮肤创面的治疗方法是临床研究的重要工作。随着人们的生活水平的不断提高提高，宠物犬饲养的数量也随之增加。各种因素造成的犬皮肤损伤的病例约占临床就诊的10%～20%。研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)能够有效地促进皮肤创面愈合[4-5]。干细胞是一类具有自我更新和分化的多潜能细胞。在一定条件下，其可以分化成多种功能细胞。具有再生各种组织器官的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。其分泌各种细胞因子，即干细胞分泌因子(stem cell-secreted factors，SCF)，具有刺激自体内源性干细胞生长，诱导机体自身干细胞至受损部位进行修复。干细胞分泌因子不仅具有与干细胞移植同样的治疗效果，而且可减少一些生物安全问题，同时，还具有更安全、更易操控的治疗优势[6-7]。多种干细胞分泌因子还能助于调节血管内皮细胞的通透性，降低机体的炎性反应，促进组织修复及抑制细菌生长[8-10]。对干细胞分泌因子的研究关注正逐渐的超过干细胞。国内外对运用干细胞分泌因子修复皮肤创面损伤的治疗有许多的研究报道，但骨髓间充质干细胞分泌因子治疗修复皮肤创面的远期疗效仍有待进一步探究，本研究旨在探讨骨髓间充质干细胞分泌因子治疗以犬为模型的皮肤创面的临床效果。

本研究用干细胞组织修复因子治疗以犬为模型的皮肤创面，与常规创面修复疗法进行比较，以期为骨髓干细胞分泌因子治疗修复皮肤创面的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

4月龄已免疫健康中华田园犬幼犬9只，性别、体型不限。常规乳膏购于英国北爱尔兰Botanica公司；注射用头孢维星购于美国辉瑞发西亚-普强公司。

1.2 方法

1.2.1 骨髓间充质干细胞分泌因子分离与保存 云南农业大学动物病理教研室分离培养，经纯化鉴定后液氮保存。

1.2.2 动物创面模型的制备 健康幼犬9只，术前30 min，注射长效抗菌素头孢维星注射液(8 mg/kg)，经腹腔注射试验动物用舒泰50(7 mg/kg)麻醉，剪除局部被毛，在其背部从头侧向尾侧分别切除3个30×30 mm全层皮肤。

1.2.3 分组 将皮肤创面损伤模型的9只幼犬，随机分为3组，分别为骨髓间充质干细胞分泌因子(BMSCF)治疗组、常规治疗组(伤复康)和对照组。其中对照组术后不给药，治疗过程中发现创口有分泌物，每日用9 g/L氯化钠注射液清洗创口2次。常规治疗组在术后治疗过程中发现创口有渗出物，在用药前先用9 g/L氯化钠注射液清洗创口，每日局部外用常规乳膏两次，每次用无菌棉签蘸取2 g常规乳膏均匀涂抹于创口表面。BMSCF治疗组术后每日局部外用犬骨髓间充质干细胞分泌因子液两次，每次用1 mL的无菌注射器吸取0.2 mL干细胞分泌因子修复液均匀滴加于创口表面。治疗过程中发现创口有渗出物，在用药前先用9 g/L氯化钠注射液清洗创口，然后再用干细胞分泌因子液。用药后分笼饲养，详细记录实验期间各组幼犬的相关情况。

1.2.4 石蜡切片及HE染色步骤 将手术切取下来的全层皮肤组织和术后新生皮肤组织放置10%甲醛溶液中固定。冲洗2 h～10 h后，依次脱水、放入二甲苯溶液中透明15 min～20 min、浸蜡、包埋、切片。切片后，置于50℃～60℃烤箱烤片2 h～3 h。放置于二甲苯溶液中5 min～10 min，之后置于酒精溶液中1 min～3 min。浓度依次为1 000、850、750 mL/L。蒸馏水浸泡。放入苏木精溶液中5 min～10 min，用自来水清洗，每次约10 s～15 s。过盐酸酒精浸洗3次，每次约3 s～5 s。再用蒸馏水水冲洗。放入5 g/L伊红染液中5 min。然后将切片依次放入950 mL/L、1 000 mL/L酒精溶液中各1 min。最后放置在二甲苯溶液中2 min。

1.2.5 愈合指标记录 ①分别记录比较对照组、常规治疗组和BMSCF治疗组创面愈合时间。②分别记录比较对照组、伤富康组合和BMSCF治疗组10 d、20 d、30 d创面残留面积。③分别对对照组、伤富康组合和BMSCF治疗组10 d、20 d、30 d 进行病理组织学观察。

2 结果

2.1 各组犬创面愈合时间

观察各组幼犬创面愈合时间。BMSCF治疗组创面愈合过程顺利，常规治疗组犬创面修复亦顺利，但BMSCF治疗组与其和对照组相比，愈合时间差异极显著(P<0.01)(表1)。对照组创面愈合时间最长，各组比较，BMSCF治疗组幼犬创面恢复最佳。

表1 各组犬创面愈合时间

注：与对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01) ； 与常规组相比，#表示差异显著(P<0.05)；##表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Compared with control group，*means significant difference(P<0.05)；**Means extremely significant difference(P<0.01)；Compared with conventional treatment group，#Means significant difference(P<0.05)；##Means extremely significant difference(P<0.01).

2.2 创面愈合残留面积

BMSCF和常规治疗创面后，观察创面愈合残留面积，治疗10 d后，BMSCF治疗组创面明显开始愈合，创面生长良好，露出粉红色的肉面；治疗20 d后，创面愈合面积增大，创面结痂明显，无红肿，无感染；治疗30 d后，创面基本愈合，创面愈合无疤痕明显，毛囊修复良好，毛干再生良好。常规治疗组创面有小面积残留。对照组犬创面30 d内未完全愈合，创面有大面积残留(图1)。BMSCF治疗组创面愈合残留面积均小于各时期对照组和常规治疗组，与对照组相比差异极显著；与常规治疗20 d和30 d相比，也具有极显著的差异(P<0.01)(表2)。

2.3 组织切片HE染色观察结果

组织切片HE染色犬创伤10 d后对照组皮肤层可观察大量中性粒细胞浸润，BMSCF治疗组较少；治疗20 d后 BMSCF治疗组可见肉芽组织生长旺盛，少量新生血管，炎性细胞减少；治疗30 d后BMSCF治疗组可见大量新生血管和大量胶原纤维，排列规则，表皮细胞修复明显可见，汗腺修复良好，毛囊生长丰富，常规治疗组可见一些新生血管，未见明显炎性细胞，胶原纤维排列稍乱，对照组仍可见炎性细胞，少量排列无序的胶原纤维。BMSCF治疗组表皮细胞分化明显，皮肤生长良好，对照组修复效果差(图2)。

图1 各组犬创面愈合残留结果

组别 Groups10 d20 d30 d对照组 Control group8.723±0.0954.399±0.0691.075±0.028BMSCF组 BMSCF group8.043±0.124** #3.317±0.105** # #0**# #常规组 Conventional drug group8.466±0.0473.968±0.034**0.103±0.004**

注：与对照组相比，*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01) ； 与常规组相比，#表示差异显著(P<0.05)；##表示差异极显著(P<0.01)。

Note:Compared with control group，*means significant difference(P<0.05)；**means extremely significant difference(P<0.01)；Compared with conventional treatment group，#means significant difference(P<0.05)；##means extremely significant difference(P<0.01).

3 讨论

皮肤是机体的重要屏障，然而各种原因造成的皮肤缺损、难愈性创面及瘢痕的病例也在逐渐增加，给临床治疗来了很大的挑战[11-12]。创面愈合主要的特征包括：组织再生、创面再上皮化和创面血管的新生。组织再生缺乏干细胞、促愈合细胞因子以及血管生成减少，都能导致创面愈合困难[13-15]。通过干细胞分泌因子来促进创面的愈合及大面积软组织损伤后的修复是一个全新思路。干细胞分泌因子能通过自分泌或旁分泌的方式改善受损部的微环境，促进机体内源性干细胞向受损部位的迁移并分化，拯救即将坏死的细胞，从而达到修复组织的目标。它还是一种可以把被动的机体自我修复转换为主动的外界主动可控的治疗手段。

干细胞分泌因子可以避免移植干细胞分化成组织细胞的低效率且移植存活时间短的缺点，其在治疗创面损伤修复方面发挥网络式的调节作用。干细胞分泌因子中含有多种创面愈合相关因子，例如：抗炎细胞因子、血管发生因子、胞外基质重塑因子以及纤维组织形成和表皮细胞再生因子[16]。同时分泌因子还具有能在体外大量生产、活性高和使用方便安全等优点，具有良好的临床应用价值。

本试验通过对创面愈合时间及创面愈合残留面积的分析发现，干细胞分泌因子可以快速地促进创面愈合，建模后，伤面愈合时间为27.66 d±0.87 d，其愈合时间较其他组均较短，各时相点干细胞分泌因子组创面愈合率均最高，创面愈合残留面积最少，30 d左右伤面基本愈合。Kim Y M等[17]认为干细胞分泌因子会促使干细胞在体内迁移并分化，动员机体其他部位的干细胞参与创伤修复。同时，干细胞分泌因子在修复神经的也参与创面愈合的炎症反应，发挥改善毛细血管通透性和增强免疫细胞的功能；促进创面成纤维细胞的增生，加快创面愈合速度；诱导表皮干细胞向创面和新鲜肉芽组织处迁移[18-21]。本试验发现干细胞分泌因子治疗组与常规治疗组及对照组比较，肉芽组织、成纤维细胞及新生血管生长更加明显；对照组伤面胶原纤维束较少且排列无序，可能是干细胞分泌因子在促进伤面愈合过程中使机体内部增加分泌生长因子。

图2 皮肤组织切片观察(HE，400×)

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