新型鸭细小病毒VP3基因克隆与原核表达

经 美，王建昌，崔 元，李晓轩，陈 萍，王金凤，侯绍华，孙继国,4，袁万哲,4*

(1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001；2.河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心，河北石家庄050051；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193；4.河北省兽医生物技术工程技术研究中心， 河北保定 071001)

2014年11月以来，我国山东、河北和安徽等地商品肉鸭群发生了以雏鸭发育迟缓、上下喙萎缩、舌头外伸为特征的疾病，养殖户俗称为“鸭长舌病”或“鸭大舌病”。该病多发生于10日龄～30日龄的肉鸭，发病率为5%～10%，患鸭后期瘫痪，不愿活动，部分患鸭因无法进食而死亡[1-2]。大多数患鸭出栏体重较健康鸭降低20%～30%，严重者仅为正常体重的50%。患鸭在抓捕、屠宰过程中胫骨等易发生骨折。根据其临床表现，该病又被称为“鸭短喙-侏儒综合征”。 目前已经确定该病的病原为新型鸭细小病毒(Novel duck parvovirus，NDPV)[1-2]。

NDPV与鹅细小病毒的亲缘关系较近，具有相似的基因组组成与结构。全基因组中包含2个主要的开放阅读框(ORF)，左侧ORF编码非结构蛋白NS1和NS2，右侧ORF编码结构蛋白VP1、VP2和VP3[3]。其中,VP3蛋白是NDPV的主要衣壳蛋白，含有病毒主要的抗原表位成分，是主要的保护性抗原，能诱导机体产生具有中和作用的抗体[4]。本研究对新型鸭细小病毒SD株的VP3基因进行了克隆，对其原核表达条件进行了探索和优化，为进一步研究NDPV抗体检测方法和新型疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

NDPV-SD株由本实验室分离并保存；2×TransTaq®HiFi PCR SuperMix Ⅰ、ExnaseTM Ⅱ 和5×CEⅡbuffer购自武汉品生科技有限公司；EasyPure Viral DNA/RNA Kit购自北京全式金生物技术有限公司；Rosetta2(DE3) pLySs、Top10感受态和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；6×His,His-TaqMonoclonal Antibody购自Proteintech公司；Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据GenBank上登录的SDLC01株基因序列(GenBank：KT001203)，应用Primer5.0软件设计1对特异性引物，在引物序列中引入5′linker和3′linker，便于后续与表达载体的重组反应。引物序列如下：上游引物P1：5′-GGG TCC AGC GGC GCT GGA TCC ATG GCA GAG GGA GGA GGC GG-3′;下游引物P2：5′-CGC TCC ACT GCC TCC TGC AGC CTA CAG ATT TTG AGT TAG ATA-3′。预期扩增的片段大小约为1 653 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 VP3基因的扩增 利用EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取鸭胚分离毒SD株的总DNA，以此DNA为模板进行VP3基因扩增。PCR扩增体系为：上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，PrimerSTAR Max(2×)25 μL，模板1 μL，加ddH2O补充至50 μL。PCR反应条件：98℃ 1 min；98℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 50 s，共35个循环；72℃延伸2 min。扩增产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的基因。

1.2.3 重组质粒pQE1-VP3的构建与原核表达 将VP3目的基因与pQE1载体按一定比例进行重组，测序正确的质粒被命名为pQE1-VP3。将阳性重组质粒pQE1-VP3转化至感受态细胞中，将重组菌于37℃培养至OD600nm值约为0.6，加入IPTG，使其终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol/L,诱导表达5 h，确定最适的IPTG诱导浓度；在最适IPTG诱导浓度下，分别诱导表达0、1、2、3、4、5、6、7、8 h，确定最佳的诱导时间；在最适IPTG浓度和最佳诱导时间下，分别在20℃、25℃、30℃、37℃诱导，确定最佳诱导温度。菌液经超声波破碎后，收集上清和沉淀进行SDS-PAGE检测。

1.2.4 VP3蛋白的纯化、复性及Western blot鉴定 用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，将纯化蛋白在含GSH-GSSG的PBS复性缓冲液中按1∶1稀释装入透析袋中，将透析袋放入复性缓冲液中按透析袋内外液体1∶20的比例透析复性24 h，用Nanodrop测定复性蛋白的浓度和纯度。将纯化的蛋白经120 g/L SDS-PAGE电泳后转膜，用50 g/L脱脂牛奶过夜封闭后，以1∶10 000稀释His标签抗体室温孵育1 h，洗膜后DAB避光显色。

2 结果

2.1 目的基因PCR扩增结果

经PCR扩增的VP3基因在大约1 600 bp处出现明显的目的条带，与预期的大小(1 653 bp)相符(图1)。表达载体pQE1在大约5 400 bp处有明显条带，与预期的大小(5 407 bp)相符(图2)。

M.DNA标准; 1.新型鸭细小病毒VP3基因M.DNA Marker; 1.NDPV VP3 gene

M.DNA标准; 1.线性化载体pQE1M.DNA Marker; 1.linearized vector pQE1

2.2 重组质粒pQE1-VP3的菌液PCR鉴定

重组质粒pQE1-VP3转入Top10菌株后，经菌液PCR鉴定，在大约1 600 bp处有明显条带，大小与预期的1 653 bp相符(图3)。

M.DNA标准; 1～8.pQE1-VP3基因M.DNA Marker; 1-8:pQE1-VP3 gene

2.3 表达产物的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE分析表明VP3基因可得到表达，蛋白分子质量约为60 ku。VP3蛋白在25℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导5 h获得最大表达量，而未诱导的菌样未出现条带(图4～图6)。可溶性分析表明，重组蛋白以不溶性的包涵体形式存在于菌体中(图7)。

2.4 重组VP3蛋白的纯化复性及Western blot鉴定分析

经Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，纯化的蛋白经含 GSH-GSSG的PBS复性缓冲液透析复性，复性条带大小与预期目的条带相符(图8)，用Nanodrop测定复性蛋白的浓度为5.165 mg/mL和纯度为97%。纯化后的目的蛋白经SDS-PAGE后转移至硝酸纤维素膜上，进行Western blot检测(图9)，约60 ku处可见有一条明显的蛋白印迹带，由此说明表达的重组蛋白具有良好的反应原性。

M.蛋白分子质量标准；1.pEQ1-VP3空质粒；2～9.pEQ1-VP3质粒经1、2、3、4、5、6、7、8 h诱导

M.Protein molecular weight Marker; 1.pEQ1-VP3 plasmid; 2-9.pEQ1-VP3 induced in 1,2,3,4,5,6,7,8 h

图4不同时间pEQ1-VP3诱导表达SDS-PAGE检测

Fig.4 SDS-PAGE detection of PEQ1-VP3 induced in different time

M.蛋白分子质量标准；1～8.IPTG 浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mmol

M.Protein molecular weight Marker; 1-8.IPTG concentrations 0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4 mmol respectively

图5不同IPTG浓度pEQ1-VP3诱导表达SDS-PAGE检测

Fig.5 SDS-PAGE detection of PEQ1-VP3 induced in different concentrations of IPTG

M.蛋白分子质量标准；1.20℃,2.25℃,3.30℃,4.37℃

M.Protein molecular weight Marker; 1.20℃,2.25℃,3.30℃,4.37℃

图6不同温度pEQ1-VP3诱导表达SDS-PAGE检测

Fig.6 SDS-PAGE detection of PEQ1-VP3 induced in different temperature

M.蛋白分子质量标准；1.诱导5 h的沉淀,2.诱导5 h的上清

M.Protein molecular weight Marker; 1.Sedimenta induced in 5 h; 2.Supematant induced in 5 h

图7 pEQ1-VP3可溶性分析

Fig.7 Solubility analysis of pEQ1-VP3

M.蛋白分子质量标准；1.目的蛋白

M.Protein molecular weight Marker; 1.Interest protein

图8蛋白复性的结果

Fig.8 The results of protein renaturation

M.蛋白分子质量标准；1.纯化蛋白

M.Protein molecular weight Marker; 1.Purified protein

图9融合蛋白His标签的Western blot鉴定

Fig.9 Idntification of fusion protein His-tag by Western blot

3 讨论

水禽类细小病毒主要包括鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)和番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus，MDPV)，该病毒属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒亚科(Parvovirinae)、依赖细小病毒属成员[5]。为单股线性DNA病毒，全基因组长5 050 nt。其基因组主要包含左右2个开放性阅读框，分别为NS基因和VP基因，阅读框两侧均有末端反向重复序列。细小病毒编码蛋白共5种，分别为VP1、VP2和VP3结构蛋白及非结构蛋白NS1和NS2[6]。VP3蛋白在3种结构蛋白中数量最多，约占衣壳蛋白总量的80%[7]，其分子质量约为58 ku，编码基因长度为1 605 nt。VP3蛋白为抗原决定簇的主要成分，构成细小病毒的保护性抗原，说明VP3蛋白具有良好的免疫原性。因此，VP3蛋白是GPV和MDPV基因工程疫苗的首选靶基因[8]。

曾将本实验室分离的SD株与MDPV和GPV进行同源性分析，发现与GPV有较近的亲缘性，核苷酸序列进行同源性比对结果可达92.7%～99.8%，而与MDPV的同源性相对较低，在79.8%～84.4%之间。该分离株为鸭源GPV，通过基因进化分析表明该分离株为GPV的变异株[9]。与GPV比较，该毒株变异主要发生在3′-UTR端，160-176与306-322 nt发生缺失(未发表)。

鉴于NDPV所致疫病是一种新发现的鸭类传染病，本研究采用qRex重组酶体系方法，将VP3基因克隆至原核表达载体pEQ1中，构建一种可高效表达蛋白的重组菌pQE1-VP3，并对其诱导表达条件进行优化，获得了在温度为25℃、1 mmol/L的IPTG浓度下诱导5 h的最大诱导表达量的方法。同时，本研究也对重组蛋白的可溶性进行了分析，发现重组的VP3蛋白以不溶性包涵体的形式表达蛋白。经过纯化和复性可得到浓度为5.165 mg/mL的VP3蛋白，其纯度可达97%。在Western blot鉴定下，可见60 ku处有明显的蛋白印迹条带。表明VP3蛋白在原核表达系统中可高效表达，并且复性的蛋白具有良好的反应原性。获得的重组菌pQE1-VP3以及高纯度的VP3蛋白，可用于建立NDPV ELISA检测方法以及开发新型疫苗。

参考文献：

[1] 宁 康，王 丹，王府民，等．樱桃谷北京鸭短喙和侏儒综合征的初步研究[J]．中国兽医杂志，2015(10)：10-13,50.

[2] 袁万哲，崔 元，经 美，等．鸭短喙-侏儒综合征研究初报[J]．中国动物保健，2016，18(5)：73-74

[3] Zadori Z,Erde J,Nagy J,et al.Characteristics of the genome of goose parvovirus[J].Avian Pathol,1994,23(2):359-364.

[4] Yin X,Zhang S,Gao Y,et al.Characterization of monoclonal antibodies against waterfowl VP3 parvoviruses protein[J].Virol J,2012,(9):288.

[5] 李 琦，李传峰，唐井玉，等．新型鸭细小病毒VP3基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J]．中国兽医科学，2016，46(6)：717-722.

[6] 黄 瑜，朱于敏，董世娟，等．雏番鸭细小病毒VP3基因的原核表达及增殖病毒的检测[J]．生物工程学报，2015，31(1)：65-74.

[7] Wang C Y,Shien H K,Shien J H,et al.Expression of capsid protein and non-structural proteins of waterfowl paroviruses inEscherichiacoliand their use in serological assays[J].Avian Pathol,2005,34(5):376-382.

[8] 张 云，耿宏伟，郭东春，等．鹅和番鸭细小病毒全基因克隆与序列分析[J]．中国预防兽医学报，2008，30(6)：415-418.

[9] 崔 元，王建昌，李玉保，等．鸭短喙-侏儒综合征及其病原的初步研究[J]．中国预防兽医学报，2016，38(5)：348-351.