河北部分猪场猪源大肠埃希菌的耐药性分析

田 瑞，刘玄福，张东林，辛树阳，霍少飞，杨彩然，刘谢荣，芮 萍，马增军

(河北科技师范学院，河北省预防兽医学重点实验室,河北秦皇岛 066600)

大肠埃希菌是一类可引起人和动物共感染的人畜共患病病原。常引起仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病。肠外致病性大肠埃希菌也可致动物肠外组织感染，使不同宿主发生脑膜炎、败血症、泌尿道感染和呼吸道感染，已引起广泛关注。多年来，畜禽生产依赖于抗生素的使用来克服细菌病压力。越来越多的证据表明，抗生素耐药性已是普遍存在的问题。2015年中国科学院广州地球化学研究所研究结果显示，2013年中国抗生素总使用量约为16.2万t，其中48%为人用抗生素，其余为兽用抗生素。另有媒体报道，我国抗生素的使用量约占世界总使用量的50%(http://c.cnhubei.com/zxzp/201506/t327035.shtml)。英国经济学者吉姆·奥尼尔发布了全球首份《反抗生素滥用报告》，报告显示，全球因为滥用抗生素，每年造成数百万人因为细菌抗药性而离世。如果不采取切实行动，到2050 年，每年全球因抗生素滥用而造成死亡的人数将超过1 000万，包括100万中国人(http:// news.youth.cn/jk /201506/t20150617-6763221.htm)。由于养猪生产中抗生素使用不规范及滥用，导致大肠埃希菌的多重耐药谱越来越宽、耐药水平不断升高，抗生素的有效性也大幅度的降低。为了解河北省规模猪场大肠埃希菌对常用抗菌药物的耐药情况，本研究对河北省9个地区分离获得的猪源大肠埃希菌进行耐药性测定，为有效防控大肠杆菌病，科学使用药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 从河北省9个代表地区的规模养猪场(秦皇岛、唐山、沧州、衡水、保定、张家口、承德、邯郸、廊坊)，采集肠拭子所分离获得的240株大肠埃希菌。大肠埃希菌AYCC25922为标准质控菌株，引自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 主要试剂和药物 试验所用培养基及生化鉴定试剂均为北京陆桥北京陆桥技术有限公司产品；氨苄西林(AM)、阿莫西林/克拉维酸(A/C)、头孢噻呋(EFT)、丁胺卡那霉素(AMK)、大观霉素(SPT)、多西环素(DOX)、氟苯尼考(FLO)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、恩诺沙星(ENR)、左氧氟沙星(LEV)、乙酰甲喹(MQD)、黏菌素(COL)等药物为河北远征生物工程有限公司产品；美罗培南(MEM)购于上海宸功生物技术有限公司；以上13种药物的配制参照CLSI(2016)标准。

1.2 方法

1.2.1 MIC值测定 严格按照美国临床实验室标准化协会(CLSI,2014)推荐的药敏试验操作方法和标准，进行微量稀释法的药敏试验及结果判断[1]。每种菌增菌至108cfu/mL，然后稀释为(105～106)cfu/mL，接种于含不同药物浓度的96孔板中，37℃水浴培养24 h，观察结果。检测结果判定按NCCLS标准执行，只有当阳性对照孔(不含抗生素)孔内细菌有明显生长，加样孔透明或孔底的沉淀不大于2 mm稀释度孔，才是该药的MIC。NCCLS中没有的按该菌株的群体分布情况判断。对所测得的MIC结果经统计学处理，得出MIC50、MIC90及MIC范围，并计算细菌对各抗菌药的耐药率(包括中介菌株)。

2 结果

2.1 各地区分离菌株

各地区分离菌株数量见表1。

表1 各地区大肠埃希菌分离数量

2.2 240株大肠埃希菌对常用药物的耐药性

通过微量稀释法测定河北部分地区9个规模化猪场猪大肠埃希菌对常用药物的最低抑菌浓度值(MIC)，并根据CLSI(2016)标准对所检测的数据进行判定其耐药R、中介I或敏感S，计算13种药物的耐药率(表2)。多数菌株对氨苄西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢噻呋、丁胺卡那霉素、左氧氟沙星耐药，耐药率分别为99.58%、98.33%、90.08%、78.75%、98.33%；对美罗培南的耐药率为15.83%；240株菌对大观霉素、多西环素、氟苯尼考、磺胺六甲氧嘧啶、恩诺沙星、乙酰甲喹、黏菌素全部耐药。

2.3 不同地区菌株对13种药物的耐药性

河北省9个地区猪源大肠埃希菌对13种药物的耐药率(包括中介)分析显示，各地区对大观霉素(SPT)、多西环素(DOX)、氟苯尼考(FLO)、磺胺间甲氧嘧啶(SMM)、恩诺沙星(ENR)、乙酰甲喹(MQD)及黏菌素(COL)药物的耐药率100%；对氨苄西林(AM)耐药率高达99%～100%，阿莫西林/克拉维酸(A/C)耐药率达89%～100%，左氧氟沙星(LEV)耐药率约在89.3%～100%，衡水、承德地区对头孢噻呋(EFT)和丁胺卡那霉素(AMK)的耐药率较低，其他地区耐药性仍高达71.4%以上。仅美罗培南(MEM)对分离菌株的耐药率较低，然而邯郸地区分离菌株对美罗培南(MEM)的耐药率高达64.3%(表3)。

表2 13种常用抗菌药物对分离大肠埃希菌的耐药率

2.4 240株猪源大肠埃希菌对13种常用抗菌药物耐药谱分析

所测得的240株大肠埃希菌中，15.83%(38/240)的菌株对13种抗菌药物全耐药，耐12种抗菌药物的菌株最多，占60.83%(146/240)，耐11种抗菌药物的菌株占15.42%(37/240)，耐10种抗菌药物的菌株相对较少占8%(19/240)。240株菌对13种抗菌药物形成8种耐药谱型，其中以12种耐药谱型氨苄西林-阿莫西林/克拉维酸-头孢噻呋-丁胺卡那霉素-大观霉素-多西环素-氟苯尼考-磺胺六甲氧嘧啶-恩诺沙星-氧氟沙星-乙酰甲喹-黏菌素为主，约占所有耐药菌谱型的59.58%(143/240)。其次为11种耐药谱型氨苄西林-阿莫西林/克拉维酸-头孢噻呋-大观霉素-多西环素-氟苯尼考-磺胺六甲氧嘧啶-恩诺沙星-氧氟沙星-乙酰甲喹-黏菌素，约占13.33%(32/240)(表4)。

表3 各地区猪源大肠埃希菌对13种药物的耐药率(%)

表4 河北省240株猪源大肠埃希菌的耐药谱

3 讨论

由于猪场饲养管理不够规范，以及猪蓝耳病、圆环病毒病、猪流行性腹泻等病毒病广泛发生，常常继发或并发大肠杆菌病，为减少经济损失，猪场频繁使用抗生素加强治疗及预防，导致猪场对常用抗生素的耐药性逐年增加。药敏试验显示，临床中分离的240株猪源大肠埃希菌大都呈多重耐药，尤其对大观霉素、多西环素、氟苯尼考、磺胺六甲氧嘧啶、恩诺沙星、乙酰甲喹、黏菌素全部耐药；多数地区分离菌株对头孢噻呋钠、丁胺卡那霉素100%耐药，只有少数地区分离株对这两种药物的耐药性低于50%；仅有美罗培南保持良好的敏感性。这些数据表明，本次分离的猪源大肠埃希菌的耐药性显著高于文献[2-4]中分离的大肠埃希菌，这与我国在猪病防治中频繁使用以上抗生素密切的联系。畜禽携带的大肠埃希菌在全球范围内都有很强的耐药性，尤其是养殖业中常用的一些抗生素，对某些抗生素耐药率达到100%，并且出现了大量多重耐药菌株，部分多重耐药株可耐12种抗生素[5]。郑重提示严禁在饲料中添加抗菌药物，取而代之的有益生素、微生态制剂、中药制剂等。对细菌感染发病动物的治疗，必须通过药敏试验选择敏感药物，既可以提高疗效，又可以避免滥用药物带来的不良反应和耐药性。

硫酸多黏菌素被喻为“抗生素最后一道防线”，是治疗革兰阴性菌引起肠道感染的首选药，2002年肖希龙等[6]报道，硫酸多黏菌素颗粒剂能有效地控制乳猪大肠埃希菌引起的下痢，降低大肠埃希菌感染乳猪的病死率，用于预防和治疗乳猪大肠埃希菌感染。但是，黏菌素作为抗菌促生长剂在畜禽养殖业中大量广泛使用，导致广泛产生耐药性[7]，本试验测得结果显示黏菌素的耐药性为100%。为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，自2016年11月1日起，中华人民共和国农业部公告第2428号，停止硫酸多黏菌素用于动物促生长。

碳青霉烯类抗生素是临床治疗多重耐药革兰阴性菌感染的最重要抗菌药物，沈建忠等[8]报道在商品鸡场的鸡、鸟、犬等动物体内分离到携带blaNDM基因的大肠埃希菌，与澳大利亚、美国、等国家临床分离的blaNDM耐药大肠埃希菌亲缘关系相近。本试验测得河北省9个地区240株猪源大肠埃希菌对美罗培南的耐药率为15.83%，部分地区达到64.3%。这些数据提示相关部门应加强相关的监测制度，养殖户和兽医人员要规范使用抗菌药物，以保障畜牧业的健康发展。

参考文献：

[1] CLSI M100-S24．Performance standards for antimicrobial susceptibility，testing; Twenty-fourth informational supplement，2014．

[2] 王基伟 ,彤盼盼,纪 雪,等.长春地区猪源大肠杆菌分离鉴定和耐药性分析 [J].中国兽药杂志 ,2014,48 ( 11 ) : 14-18 .

[3] 岳秀英,葛 荣,吴晓岚,等.四川省猪、鸡源大肠杆菌对抗生素耐药性研究[J].中国兽医杂志,2017,53(1):93-95.

[4] 矫薇薇,徐国锋,王宏栋,等.江西地区猪源致病性大肠杆菌的耐药性试验[J].中国兽医杂志,2015,51(10):77-79.

[5] 高海涛,韩俊丽,关道明.大肠杆菌耐药现状的严峻性[J].生命科学,2017，29(5)：514-520.

[6] 肖希龙,沈建忠,汤树生,等.硫酸多粘菌素颗粒剂对乳猪大肠杆菌感染的预防和治疗试验[J].饲料工业,2002,23(6):46-47.

[7] 易灵娴,刘艺云,刘健华,等.质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1研究进展[J].遗传,2017,39(2):110-126.

[8] Shen J.Wang Y,Zhang R,et al.Comprehensive resistome analysis reveals the prevalence of NDM and MCR-1 in Chinese poultry production[J].Nat Microbiol，2017,25(6):24.