猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒研制及应用

李 爽，荣桂芬，盛英霞，陈银辉，温 凯，华利忠，熊雅婷，杨若松*

(1.北京维德维康生物技术有限公司，北京 100095；2.山东省畜牧兽医信息中心，山东济南 250022；3.江苏省农业科学院兽医研究所，南京江苏 210014)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)隶属于圆环病毒科，是一种较小的、无包膜的、环状排列的单链DNA病毒[1]。猪圆环病毒2型相对于猪圆环病毒1型来说，具有致病性，可引起猪圆环病毒病。在猪生长发育过程中，PCV-2的感染与多种临床表现密切相关，通常归结为PCV-2相关疾病(PCVAD)，包括全身性疾病、肠炎和肺炎[2]。除了引起PCVAD外，PCV-2感染可能导致延长亚临床疾病的病发期，这可能对猪的育肥以及猪肉品质产生消极的影响[3-4]。

1974年，研究者们首次发现在永久性传代的猪肾细胞系中存在一种病毒样的“圆形小颗粒”，8年后，被证实是一种新的病毒——猪圆环病毒。1996年，加拿大学者从患断奶后仔猪多系统衰竭综合征的猪体内分离到 PCV变异株，将其命名为PCV-2[5]。2000年，我国猪场首次发现了PCV-2。猪圆环病毒病作为对全球养猪业具有重大威胁的主要疾病之一[6]，也是我国重点原种猪场监测疫病之一。因此，一个好的临床诊断关乎着PCV-2的监测与净化。当前，临床上诊断主要是PCV-2间接ELISA方法。市场上，现有的试剂盒参差不齐，可选择性偏少，故而进行符合市场需求的商品化试剂盒研究。PCV基因组由一条共价闭合环状单股DNA构成，包含2个大的开放阅读框架ORF1和ORF2，分别编码病毒蛋白复制酶(Rep)和病毒衣壳蛋白(Cap)[7]。Cap蛋白具有良好的免疫原性和反应原性，可以进行较好的血清学诊断。本研究以此为包被抗原，建立ELISA方法并优化反应条件，最终形成产品，进行猪圆环病毒2型的血清学诊断。

1 材料与方法

1.1 材料

PCV-2原核表达重组Cap纯化蛋白由本公司合成、表达及纯化；辣根过氧化物酶(HRP)羊抗猪购自亿米诺公司；TMB底物显色液为本公司自备；PCV-2阴阳性对照血清由本公司实验室制备；样本血清为本公司样本库保存；胎牛血清购自美国Gibco公司；96孔可拆式酶标板、酶标仪购自美国Thermo公司；猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒购自于韩国金诺公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 猪圆环病毒2型间接ELISA的建立及优化 对抗原包被量、抗原包被条件、封闭液成分、孵育温度、样品稀释液和二抗稀释液成分，二抗稀释度等进行优化，根据P/N值建立最佳条件。

1.2.2 猪圆环病毒2型间接ELISA反应体系的确立 取酶标板(根据样品多少，可拆开分次使用)，将待检血清进行1∶50稀释，取100 μL加至酶标板中。同时设阴、阳性对照各2孔，取阴阳性对照取100 μL加入孔中(不用稀释)。轻轻振匀孔中样品，盖上盖板膜，置室温下温育30 min。弃去孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液260 μL，静置30 s后，弃去洗涤液；洗涤4次后在吸水纸上拍干。配制酶结合物工作液：按1∶100，混匀。每孔加酶结合物工作液100 μL，盖上盖板膜，室温(25℃±2℃)下温育30 min。弃去孔中的溶液，洗涤4次后在吸水纸上拍干。将底物A液与底物B液按1∶1混合均匀，加入孔中，100 μL/孔，盖上盖板膜，室温下反应10 min。每孔加入终止液50 μL，5 min内于450 nm/630 nm处测定OD值。

1.2.3 猪圆环病毒2型间接ELISA阴阳性判定标准的建立 利用建立的方法，检测阴性对照血清和阳性对照血清OD450 nm/630 nm差值，并检测通过标杆产品韩国金诺公司产品筛选的20份阴性血清和20份阳性血清OD450 nm/630 nm差值，计算出阴性对照平均OD值和阳性对照平均OD值，以S/P值作为判定阴阳性的标准。

1.2.4 与国外标杆产品的比对 用本自制产品与韩国金诺公司产品对187份猪血清进行检测，后分析本自制产品的敏感性、特异性和符合率。

1.2.5 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的批间、批内重复性 用3个不同批次组装的试剂盒检测同样5份血清，根据OD450 nm/630 nm差值标准差和变异系数分析其批间重复性。使用同一批次组装的试剂盒检测同样5份血清,根据OD450 nm/630 nm差值标准差和变异系数分析其批内重复性。

1.2.6 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒稳定性试验 4℃条件下，利用同一份血清检测OD450 nm/630 nm差值以及阴阳性对照血清OD450 nm/630 nm差值。检测时间分别为0 d、15 d、1个月、3个月、6个月和12个月。计算3批次的S/P值，探究试剂盒的有效期。

1.2.7 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的应用 利用自制猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒产品对江苏A猪场和B猪场进行猪圆环病毒2型抗体检测。江苏A猪场随机抽取哺乳期、保育期、断奶期、育肥期、怀孕和空怀猪共45份样品进行检测，B猪场检测15头免疫疫苗母猪的基础上，探究后代不同周龄的仔猪抗体水平变化。

2 结果

2.1 猪圆环病毒2型间接ELISA的建立及优化

根据P/N值确定了抗原包被浓度为2 μg/mL，4℃包被过夜，封闭液选用50 mL/L胎牛血清-PBST液，37℃封闭2 h；待检血清以PBS缓冲液按1∶50稀释，室温孵育30 min；酶结合物以自制含防腐剂酶结合物稀释液按照1∶100稀释，室温下孵育30 min；TMB底物显色液，室温下显色10 min；浓硫酸终止显色，用酶标仪450 nm/630 nm波长测定各反应孔的OD值。

2.2 猪圆环病毒2型间接ELISA阴阳性判定标准的建立

对阴性对照血清、阳性对照血清、20份阴性血清和20份阳性血清OD450 nm/630 nm差值(表1)。结果表明，阴性对照OD450 nm/630 nm平均值为0.118，阳性对照OD450 nm/630 nm差值平均值为2.132。综合阴阳性血清结果得出，当阴性对照平均OD值<0.20且阳性对照平均OD值>1.0，试验结果才有效；否则，应进行重复试验。根据公式S/P=(样本OD值-阴性对照平均值)/(阳性对照平均OD值-阴性对照平均值)，确定判定方法为S/P≥0.15为阳性；0.15>S/P≥0.1判为可疑；S/P<0.1为阴性。

表1 ELISA检测猪血清结果(OD450 nm/630 nm差值)

2.3 与国外标杆韩国金诺公司产品的比对

与韩国金诺公司产品完成了267份临床样本的比对试验，结果证明，本研究中发明的ELISA产品与标杆产品的阳性符合率为97.8%，阴性符合率为92.8%，总体符合率达到了95%(表2)。

2.4 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的批间、批内重复性

用3个不同批次组装的试剂盒检测同样5份血清OD450 nm/630 nm差值，结果见表3。批间变异系数在1.20%～6.89%之间，均小于10%。表明猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒不同批次间的可重复性比较好。

表2 与国外进口标杆品牌符合度对比结果

使用同一批次组装的试剂盒检测同样5份血清,根据OD450 nm/630 nm差值标准差和变异系数分析其批内重复性(表4)。批内变异系数在0.90%～6.21%之间，均小于10%。表明猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒同批次内的可重复性比较好。

2.5 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒4℃保存试验

4℃条件下，测得0 d、15 d、1个月、3个月、6个月、12个月结果，可见4℃条件下，12个月S/P值基本恒定，故可以保存1年(表5)。

2.6 猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒的应用

利用本研制猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒对江苏A猪场(未免疫)和B猪场(母猪产前1个月免疫勃林格殷格翰圆环灭活疫苗，仔猪出生21后免疫该疫苗)进行猪圆环病毒2型抗体检。江苏A猪场阳性率为82.2%，B猪场免疫母猪及后代的阳性率为98.3%(表6)。对江苏A猪场这45头母猪及育肥猪进行S/P值分析比较得出，断奶和保育时(4周、6周)S/P值较低(图1)。B猪场免疫母猪及后代基本都是阳性，但母猪相对子代的抗体水平高(图2和图3)。

表3 批间重复性试验结果

表4 批内重复性试验结果

表5 4℃保存试验(S/P值)

3 讨论

猪圆环病毒病给全球的养猪业带来了巨大的冲击，包括断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、呼吸道疾病综合征、增生性坏死性肺炎、新生仔猪先天性震颤与怀孕母猪的繁殖障碍等疾病，而断奶仔猪多系统衰竭综合征致死率最高[8]。猪圆环病毒Cap蛋白为病毒的独特的结构蛋白，是主要的免疫原性蛋白[9-10]。本研究采取低温低诱导剂浓度原核表达获取Cap纯化蛋白，保证了蛋白正常折叠、可溶性表达，防止蛋白异常折叠形成包涵体，尽最大可能维持原有的抗原表位，利于该病的诊断。并且采取大肠杆菌原核表达有利于较短时间获得大量抗原，保证了试剂盒产品原料的供应。

表6 江苏A猪场和B猪场ELISA检测结果

图1 A猪场猪圆环病毒抗体S/P值

图2 B猪场猪圆环病毒抗体S/P值

实线指阳性阈值，虚线为阴性阈值

The solid line refers to the positive threshold,and dashed line is the negative threshold

图3 B猪场猪圆环病毒抗体S/P值及离散度

Fig.3 S/P values and dispersion of PCV-2 antibody

我国国标中，采用PCR方法检测PCV-2抗原来诊断该病。PCV-2抗体竞争ELISA方法以其良好的特异性[11]也被越来越多地应用。免疫组化也是检测PCV-2抗原经典的检测方法。后有生物学家在此方法基础上，使用免疫胶体标记抗体，提高了检测效果。另外，还有免疫荧光的方法。目前，国内外均已有免疫荧光PCV-2检测试剂盒。本产品与本研究参比标杆产品韩国金诺公司猪圆环病毒2型抗体ELISA检测试剂盒同为间接ELISA方法。无论从敏感性、特异性还是总体符合率，二者具有高度一致性。说明本研制产品具有较好的诊断效果，其结果可靠性较好。

利用本研制试剂盒对猪场进行检测，可以看出，猪圆环病毒2型在我国猪场普遍存在，这与文献[12]报道一致。A猪场研究发现，断奶和保育时(4周、6周)抗体水平低，可能是由于体内含有少量母源抗体，一方面含量较低，另一方面抵抗野毒感染。育肥期母源抗体减少，又受到外界感染，导致抗体水平升高。B猪场免疫后，母猪抗体水平较高且与子代基本都为阳性，说明疫苗免疫效果较好。不同周龄的仔猪的抗体消涨变化侧面也印证母源抗体降低，可能又诱发新的感染状况。因此，通过猪圆环病毒2型间接ELISA抗体检测试剂盒的应用，对免疫猪场抗体监测以及带毒猪场的净化具有重要的意义。

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