猪膝关节早期骨性关节炎模型的建立

吴清洪，杨朝湘，邹华章，王玉珏

(1.南方医科大学实验动物中心，广东广州 510515；2.广东省妇幼保健院放射科，广东广州 510010；3.广州市南方医院增城院区骨科，广东广州 511340)

膝骨性关节炎(Knee osteoarthritis,KOA)是严重影响中老年人生活质量的常见病。目前临床诊治的多数KOA病例已是症状明显的中晚期，其软骨病损多已不可逆。如果在KOA发展的早期阶段即能诊断并临床干预，则有可能使KOA的软骨退变进程在早期被阻断甚至逆转，从而改变目前KOA临床治疗基本上都是中晚期，只能以缓解症状为主的被动局面。而通过T1ρ、T2 mapping等功能性磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)新技术来实现在体无创性早期诊断KOA，已成为当前的一个研究热点。

由于限于临床现实和伦理的考虑，常难以获得人的早期KOA研究样本。因此，就需要通过建立早期KOA动物模型来进行相关研究。目前，关于如何在体建立KOA软骨退变动物模型的研究很多，但其中的多数只关注于如何成功建模，真正专注于将建模限定于KOA早期阶段的不多。另外，多数KOA动物模型研究采用的是小型动物，如鼠、兔等。而小型动物的膝关节软骨过于菲薄，多仅能用于病理研究，而无法满足功能性MRI等影像学方法进行成像研究的需要。为此，我们探索采用大型实验动物猪，并以手术方式来建立早期KOA动物模型。

1 材料与方法

1.1 材料

西藏小型猪12只，10月龄～12月龄，体重33 kg～36 kg，均为雄性，购于南方医科大学实验动物中心[许可证号：SCXK(粤)2011-0074]。动物随机分为4组，每组3只。

1.2 方法

实验猪先经臀部肌注氯胺酮麻醉后，右侧卧并四肢捆绑固定于手术台。开放耳静脉推注氯胺酮以维持全身麻醉。麻醉满意后，左后腿膝关节备皮，碘伏消毒后，铺无菌治疗巾。自膝外侧作切口至关节腔,推开髌骨、髌韧带,屈曲膝关节,切除外侧半月板并离断前交叉韧带。以抽屉实验确认关节失稳后,冲洗关节腔并逐层缝合。右侧膝关节不予处理留做空白对照侧。术后3 d每天肌注160万单位青霉素钾一次以预防感染。常规饮食饲养，不固定肢体，任其自由活动。4组实验猪分别于术后饲养2、4、6、8周。

2 结果

2.1 术后一般情况

一般于术后最初的3 d～5 d内，动物饮食及活动量较术前减少，跛行，手术侧后肢不愿着地。至术后1周，所有12头猪的手术创口均一期愈合，未出现感染表现。饮食及活动渐恢复正常，手术侧后肢逐渐正常着地。每组饲养到相应的观察时间点，均未出现动物死亡，也未再出现肢体活动障碍及跛行。

2.2 MRI检查及图像观察

4组实验猪在饲养至预定周数后麻醉处死。自髋关节离断双侧后腿后，于2 h内分别完成手术侧和对照侧膝关节MRI扫描。MRI机为Philips Achieva 3.0T TX扫描仪。采用12通道SENSE膝关节表面线圈。将猪膝关节置于线圈内并予固定。蹄先进，髌骨下缘平定位中心线，行矢状位扫描。先行3D WATS(3D T1-weighted fast field echo with water-selective excitation)序列扫描。扫描参数：TR/TE = 20 ms/4.9 ms，翻转角20°，FOV 140 mm，矩阵 256×256，层厚3 mm。然后分别行T1ρ和T2 mapping成像。T1ρ成像采用3D稳态梯度回波序列。扫描参数：自旋锁定频率(spin-lock pulse amplitude)500Hz，自旋锁定时间(time of spin lock)分别为1,10,20,30,40 ms；TR/TE = 5.9/3.0 ms，FOV 140 mm，翻转角 50°，矩阵256×256，层厚3 mm。T2 mapping成像采用5回波快速自旋回波序列，扫描参数：TR/TE=1 368 ms/10,20,30,40,50 ms，FOV 140 mm，翻转角90°，矩阵256×256，层厚3 mm。将T1ρ成像数据调入工作站的IDL后处理软件，以生成T1ρ弛豫时间图(T1ρ relaxation map)。观察各组3D WATS序列图像、T1ρ弛豫时间图及T2 mapping图上的软骨显示情况并测量软骨厚度，看是否能够满足磁共振成像研究的需要。各组对照侧膝关节3D WATS序列图像，及术侧膝T1ρ弛豫时间图和T2 mapping矢状位图像上均能良好显示软骨(图1)。所测猪膝关节软骨厚度为1.0 mm～1.3 mm。完全能够满足功能性MRI研究的需要。

左、中、右图分别为术后4周组之术侧膝关节外侧矢状位3D WATS序列图像、T1ρ弛豫时间图和T2 mapping图像。各图均能良好显示出有足够厚度的关节软骨

Left,middle and right images demonstrate 3D WATS,T1ρ mapping and T2 mapping of lateral porcine knee joint cartilage 4 weeks post surgery,respectively.These images all demonstrate the thickness of cartilage

图1术后4周猪膝关节软骨磁共振图

Fig.1 Magnetic resonance images of porcine knee joint cartilage after 4 weeks post surgery

2.3 大体病理学观察

完成MRI扫描后，剖检双侧猪膝关节。肉眼观察空白对照侧和手术侧股胫关节软骨，尤其是股骨外侧髁及胫骨平台外侧软骨的情况。包括软骨颜色、透明度，软骨表面是否光滑，有无磨蚀及缺失。术后2周组，见膝关节各软骨表面光滑连续，均未出现明显软骨变软及颜色异常变化。术后4周组，可见半月板切除对应处之股骨外侧髁及胫骨平台外侧软骨局部稍泛黄并呈光泽度及透明度略下降改变。但软骨表面仍光整，未出现明显磨蚀征像。术后6周组，于半月板切除对应处之股骨外侧髁及胫骨平台外侧软骨出现明显透明度下降改变，局部软骨稍显磨蚀样表现。术后8周组，半月板切除对应处之股骨外侧髁及胫骨平台外侧软骨均出现明显软骨磨蚀和溃疡形成，局部软骨已呈部分缺损状。

2.4 组织学检查

用骨凿于手术侧膝关节股骨外侧髁及胫骨平台外侧之切除半月板对应处关节面，分别凿取1.0 cm×0.5 cm大小带少量软骨下骨的关节软骨片。100 mL/L甲醛溶液固定24 h后置于300 mL/L甲酸甲醛液中完全脱钙。石蜡包埋切片，进行番红O染色。光学显微镜下观察，以OARSI分级标准[1]评估关节软骨的组织学改变。术后2周组软骨表面光滑，无纤维化，仅部分出现软骨细胞增多改变，番红O染色于软骨浅层稍显失染。OARSI分级为1～1.5级；术后4周组软骨表层出现纤维化，并细胞数减少或消失。番红O染色显示软骨上1/3失染，OARSI分级为1.5～2.5级；术后6周组软骨浅层弥漫性纤维化，并见有小的纵向裂隙形成。番红O染色显示软骨失染扩展到上1/2。OARSI分级为3～3.5级；术后8周组软骨软骨浅层严重磨损，纵向裂隙扩展到软骨中层。番红O染色显示软骨大面积失染。OARSI分级为3.5～4.5级(图2)。其中，术后4周组软骨最符合早期KOA软骨改变。

A.术后2周组软骨表面光滑，出现软骨细胞增多改变，番红O染色显示软骨浅层稍显失染；OARSI分级为1～1.5级。B.术后4周组软骨表层出现纤维化，并细胞数减少或消失。番红O染色显示软骨上1/3失染；OARSI分级为1.5～2.5级。C.术后6周组软骨浅层弥漫性纤维化，并见有小的纵向裂隙形成。番红O染色显示软骨失染扩展到上1/2；OARSI分级为3～3.5级。D.术后8周组软骨软骨浅层严重磨损，纵向裂隙扩展到软骨中层。番红O染色显示软骨大面积失染；OARSI分级为3.5～4.5级

A.Cartilage of the group 2 weeks post surgery shows smooth surface,with proliferation of chondrocyte and mild loss of staining in the shallow layer,OARSI grade is 1-1.5.B.Cartilage surface of the group 4 weeks post surgery shows fibrosis,with decrease or elimination of chondrocyte and loss of staining in the upper 1/3 layer,OARSI grade is 1.5-2.5.C.Cartilaginous shallow layer of the group 6 weeks post surgery shows diffuse fibrosis,with small longitudinal clefts and loss of staining in the upper 1/2 layer,OARSI grade is 3-3.5.D.Cartilaginous shallow layer of the group 8 weeks post surgery shows severe erosion,with deep longitudinal clefts and loss of staining far beyond the upper 1/2 layer,OARSI grade is 3.5-4.5

图2 4组术后猪膝关节软骨番红O染色结果

Fig.2 Safranin O staining of 4 groups of porcine knee joint cartilage after surgery

3 讨论

3.1 采用猪来建立在体KOA模型的必要性

功能性MRI技术，如T1ρ和T2 mapping在OA的诊断，尤其是早期诊断中发挥着重要的作用[2]。模拟早期关节炎(OA)变化的离体的猪或牛髌骨MRI研究表明，T1ρ、T2 mapping等功能性MRI技术能够发现早期OA软骨细胞外基质(extracellular matrix,ECM)中生化成分的变化[3-4]。离体研究结果需要在体研究来进一步证实。为此，很多研究采用鼠、兔等小动物来建在体KOA模型[5-6]。用小动物建模具有经济、操作相对方便等优点，做病理学研究很适合，但若进行功能性MRI研究，则最大问题就是小动物关节软骨过于菲薄，如成年兔股骨髁透明软骨厚度仅为400 μm，为人类的1/7～1/5[6]。这个厚度仅相当于MRI成像的一个像素大小。这就给清晰地显示软骨以及在图像上准确地进行相关测量带来一定困难。为此，采用大动物(如猪)来建立在体KOA模型就显得非常必要。本研究测得小型猪的软骨厚度在1.0 mm～1.3 mm。而且无论是常规MRI序列，还是T1ρ和T2 mapping成像，膝关节软骨均能清晰地显示。较之兔等小动物优势明显。此外，猪膝关节的解剖结构及软骨的组织结构与人的非常相似。猪在站立和移动过程中膝关节有大量的屈曲动作。这也使得采用猪所建立的KOA模型较符合人的KOA的实际情况。

3.2 建立在体早期KOA动物模型的意义

KOA诊治的发展方向是早诊断早干预。而其中的关键是在KOA发展的早期阶段能予以明确诊断。由于目前临床上接诊的KOA病人多已有明显症状而处于中晚期。因此，KOA的早期诊断研究主要采用建立在体动物模型的形式。在已往有关在体KOA动物模型的研究中，多关注于如何成功地建立KOA模型，而专注于建立在体早期KOA动物模型的研究较少。如被广泛使用的Hulth造模法[7]，虽然建模成功率高，但由于造模时创伤较重，且软骨退变迅速，并不适合稳定地建立早期KOA模型。针对Hulth法所存在的问题，近些年来的许多KOA相关研究多采用不同于Hulth法的造模方法，如减少手术范围的改良Hulth法、关节内注射药物法等[8-9]。但这些研究仍多着眼于造模的成功率。部分研究虽然也涉及到早期KOA模型的建立，但也多采用的是小动物[5,8]。本研究专注于采用大动物猪来稳定地建立在体早期KOA动物模型。大体病理观察与组织学检查表明，术后4周的模型非常符合早期KOA的软骨退变改变，可作为稳定的在体早期KOA模型供相关的MRI诊断研究之用。

稳定的在体早期KOA动物模型同时也是早期治疗相关研究所必需的。此类研究需要明确是处于KOA早期阶段的活体动物模型，在治疗措施干预之后，观察退变软骨有无逆向性变化，以验证治疗措施是否有效[10]。而以猪等大动物所建立的早期KOA模型，还能够满足干预后在不同时间点进行活体状态下功能性MRI评估的需要，可成为KOA早期治疗相关研究非常合适的模型平台。

3.3 以手术方式建立早期KOA动物模型的优点

以人工干预的方式建立KOA动物模型的方法有多种，用于大动物的主要有两种。一种是向膝关节腔内注射致软骨降解的药物；另一种即以手术方式破坏或切除膝关节部分维稳结构，如交叉韧带、半月板等，以使关节负荷传导紊乱，重力负荷相对集中于较小的关节面区域，促使该区域软骨发生快速退变。本研究在建模时切除猪膝外侧半月板并离断前交叉韧带，使得股骨外侧髁和胫骨平台外侧面软骨承受更大的负荷而发生退变。只要控制好时间，即可形成符合早期KOA改变的动物模型。以手术方式建立早期KOA模型，比向关节腔内注射药物的建模方法更稳定可控。向关节腔注射药物法虽然创伤小、易操作，但因注射的药物有一定的作用时间，在药物失效后，已发生退变的软骨可通过自身修复而逆转，无法形成稳定的模型[11]。因此，这种模型要么只能在注射药物后的一定时间内加以利用[12]，但这不符合治疗相关研究对模型应持续稳定的需要；要么在一定时间后再补注药物[6]，但补注既增加了操作的复杂性，也不易控制软骨退变的进程而可能使退变超出了早期KOA的范围。

3.4 研究的不足

本研究的不足，一是样本例数较少。二是受客观条件的限制，MRI检查是在处死动物后进行的，未能在活体状态下进行。而活体状态下的影像学检查是KOA治疗相关研究进行连续效果评估所需要的。因此，更大样本量的、采用活体状态下影像学评估的研究将是下一步的目标。

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