节律基因Clif单核苷酸多态性与汉族人群急性心肌梗死的关联分析

陈晨 江舟 程敏 曹丽萍 周刚 王正荣四川省科学城医院（四川绵阳6900）；四川大学华西基础医学院与法医学院生物医学工程研究室（成都 6004）；卫生部时间生物学重点实验室（成都 6004）

流行病学调查发现近年随着我国人民生活水平的不断提高，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）发病率逐年升高，成为严重危害人类健康的常见病。单核苷酸多态性（Single nucleo⁃tide polymorphism，SNP）是指在基因组水平上单个核苷酸的变异所导致的一种DNA序列多态性。研究发现AMI的发生发展过程与易感基因的SNP密切相关［1-2］。通过病例-对照的突变分析，搞清这类SNP与异常表型之间的关系，进而阐明AMI的遗传机制。近年的研究表明，近日节律钟基因多态性确实与许多疾病的发病存在某些关联。通过回顾国内外的研究，笔者发现以下节律基因的SNP位点与众多躯体疾病密切相关。例如：clock、clif及npas2等都存在SNP位点与睡眠相位波动、孤独、季节性情感障碍、双向抑郁等疾病发生相关［3-5］；bmal1与clock还与不孕不育有关联［6］；period1、period3与海洛因、可卡因、冰毒等成瘾性关系密切［7］。近日钟基因的突变或表达异常常导致心血管疾病的发生。BRAY等［8］对clock突变的小鼠心肌收缩力进行了研究，结果发现当clock基因突变后小鼠的心肌收缩力、代谢功能以及相关基因表达均发生了改变，也就是说当clock基因突变时易导致小鼠发生心血管疾病。TAKEDA等［9］采用基因芯片检测技术对血管内皮细胞表达钟控基因进行了分析检测，他们发表有229个基因其内CLOCK/BMAL2上调，其中TM（凝血调节蛋白）也是受CLOCK/BMAL2调控的钟控基因。为进一步明确近日钟基因在心肌缺血发生发展中的作用及机制，本课题致力于节律基因Clif SNP与汉族人群AMI的关联分析。笔者拟对AMI患者Clif基因多态性进行多位点研究，为临床AMI的防治提供更多实验依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集我院心内科2014年6月至2016年1月确诊的汉族急性心肌梗死患者120例作为病例组，年龄为38～84岁；并采集同期体检中心的78例汉族健康人群作为对照组，年龄32～77岁。分别于清晨7：00时抽取5 mL抗凝血液进行生化指标检测包括三酰甘油、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等指标，其中3 mL留作DNA分离进行基因测定。所有实验标本的收集均经本医院的医学伦理委员会认可并获得患者知情同意。

1.2 实验仪器 普通PCR仪、电泳仪及凝胶成像系统购自美国BIO⁃RAD公司，NanoDrop 2000c紫外分光光度计购自美国ThermoScientific公司，普通离心机及电热恒温水浴箱购自北京永光明医疗仪器厂，荧光定量PCR仪购自美国罗氏公司。

1.3 实验试剂 总RNA抽提试剂Trizol购自美国Invitrogen公司。人全基因组DNA提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0），逆转录试剂盒（SMART®MMLV Reverse Transcrip⁃tase），荧光定量 PCR试剂盒（SYBR®Premix Ex TaqTMII kit）均购自日本Takara公司。SNaPshot试剂盒购自美国ABI公司。Pai⁃1（血浆纤溶酶原激活抑制物⁃1）和血栓素（thrombomodulin，Tm）酶联免疫吸附试验试剂盒购自美国Sigma公司。节律基因 Clif（aryl hydrocarbon receptor nuclear transloca⁃tor like 2）慢病毒干扰试剂盒购自中国上海吉玛公司。PCR扩增引物由上海生工公司合成。

1.4 DNA的提取 选取采集的新鲜血细胞，按照人全基因组DNA提取试剂盒说明书，提取各标本中的全基因组DNA。随后将DNA使用NanoDrop 2000c紫外分光光度计测定所提取每个样本的全基因组浓度，并放于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.5 单碱基引物延伸法基因分型（SnapShot） 按照SnapShot试剂盒进行反应。反应体系如下：PCR产物总体积 9 μL，Exol酶 0.1 μL，SAP buffer 0.1 μL，SAP 2 μL，加灭菌水至总体积12 μL。反应条件：37℃1 h；75℃15 min。随后进行单碱基引物延伸，反应体系：纯化后产物1 μL，SNapShot Multi⁃plex 1 μL，SnapShot primer 0.2 μL，加灭菌水至总体积5 μL。反应条件：96℃预变性1 min；96℃变性10 s，50℃退火5 s，60℃延伸30 s，共25个循环。随后采用1%琼脂糖电泳检测PCR产物大小，取出凝胶在凝胶成像系统记录并鉴定提取结果。

1.6 RNA干扰技术 C57BL/6J小鼠购自南京动物模式研究，动物实验经我院医学伦理委员会批准。参照Clif基因慢病毒干扰试剂盒，采用小鼠尾静脉注射干扰物，沉默小鼠Clif基因的表达，并采用荧光定量PCR测定小鼠血浆Clif mRNA的表达水平变化。

1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA） 采用双抗体夹心法测定慢病毒干扰前后小鼠血浆中PAI⁃1和血栓素（TM）蛋白含量的变化表达水平。主要原理如下：用纯化的一抗包被微孔板，制成固相抗体，往微孔中加入血清，再加入与酶标记过的二抗结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加显色剂显色。

1.8 总RNA提取、逆转录及荧光定量PCR反应 收集各组小鼠的血浆，按照Trizol试剂盒说明书抽提标本总RNA。用NanoDrop 2000c紫外分光光度计对提取的总RNA进行定量后，取1 μg总RNA按照试剂盒说明书进行逆转录反应（reverse transcription，RT）合成cDNA，随后将cDNA放置-80℃超低温冰箱保存备用。

按照SYBR®Premix Ex TaqTMⅡkit试剂盒进行荧光定量PCR反应。反应体系如下：SYBR®Pre⁃mix Ex TaqTMⅡMix 10 μL，正、反向引物（10 μmol）共2.0 μL，cDNA 1 μL，灭菌水7 μL，引物序列见表1。反应条件如下：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，60℃退火+延伸30 s，共40个循环，4℃冷却30 min，反应结束后置4℃保存。以Gapdh为内参，采用2－△△CT方法［10］分析各基因相对表达量。

表1 基因引物序列信息Tab.1 Sequence information of gene primers

1.9 统计学分析 采用Statistical Program for Social Science 18.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）统计软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差表示，并采用t检验。基因型和等位基因频率分析采用基因计数法计算，研究对象与Hardy Weinberg平衡的符合程度、单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表卡方检验，以95%可信区间（CI）表示相对风险度。以P＜0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料 观察组与对照组临床资料统计结果见表2。经统计分析发现，两组人群性别和年龄差异无统计学意义（P＞0.05）；而观察组总胆固醇、三酰甘油及低密度脂蛋白指标明显高于对照组，两者比较差异有统计学意义（P＜0.05），提示上述3项指标与AMI发生密切相关。

表2 观察组与对照组临床资料统计比较Tab.2 Statistical comparison of clinical data between the experimental group and the control group ±s

表2 观察组与对照组临床资料统计比较Tab.2 Statistical comparison of clinical data between the experimental group and the control group ±s

注：与对照组相比，*P＜0.05

组别观察组对照组P值例数120 78年龄（岁）46.3±5.6 48.4±6.8 0.72性别（女/男）45/75 31/47 0.89 HDL⁃C（mmol/L）1.91±0.85 1.36±0.31 0.17 TC（mmol/L）4.49±1.03 2.84±0.76 0.005*TG（mmol/L）1.92±1.56 1.23±0.66 0.002*LDL⁃C（mmol/L）3.75±0.88 2.78±0.63＜0.001*

2.2 Clif基因多态性位点基因型频率分布在观察组与对照组中的比较 通过Hardy⁃Weinberg遗传平衡对全部数据进行检验，结果表明样本选择达到了Hardy⁃Weinberg遗传平衡，表明本实验选择的样本具有代表性。观察组与对照组中Clif基因的基因型频率分布情况及其统计分析见表3。结果表明，Clif基因rs2289709位点的基因型频率分布在实验组与对照组中差异存在统计学意义（P＜0.05）；而rs62758860位点基因型频率分布在观察组与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 Clif基因多态性位点等位基因频率分布在观察组与对照组中的比较 观察组与对照组中Clif基因的等位基因频率分布情况及其统计分析见表4。结果表明，Clif基因rs2289709位点的等位基因频率分布在实验组与对照组中差异存在统计学意义（P＜0.05）；而rs62758860位点等位基因频率分布在观察组与对照组比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。

2.4 小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，血浆中Clif、Pai⁃1和Tm基因mRNA表达变化 采用小鼠尾静脉注射干扰物，沉默小鼠Clif基因的表达，并采用荧光定量PCR测定上述基因mRNA的表达变化。结果见图1，以对照组小鼠血浆Clif的表达量为1，则慢病毒转染组Clif的表达量为0.17±0.08；以对照组小鼠血浆PAI⁃1的表达量为1，则慢病毒转染组PAI⁃1的表达量为0.39±0.12；以对照组小鼠血浆TM的表达量为1，则慢病毒转染组TM的表达量为0.56±0.15。上述结果表明小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，Clif、PAI⁃1和TM基因表达水平均较对照组显著下降（P＜0.05）。

表3 Clif基因多态性位点基因型频率分布在实验组与对照组中的比较Tab.3 Comparison of genotype frequency distribution of Clif gene polymorphic loci in experimental group and control group

表4 Clif基因多态性位点等位基因频率分布在观察组与对照组中的比较Tab.4 Comparison of allele frequency distribution of Clif gene polymorphism in experimental group and control group

图1 小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，血浆中Clif、Pai⁃1和Tm基因mRNA表达变化Fig.1 Changes of mRNA expression of Clif，Pai⁃1 and Tm genes in plasma after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice

2.5 小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，血浆中蛋白PAI⁃1和TM水平表达变化 采用酶联免疫吸附试验检测小鼠血浆中PAI⁃1和TM蛋白水平，结果见表5。分析发现，小鼠体内射慢病毒Clif干扰质粒后，其血浆PAI⁃1和TM蛋白水平均较对照组小鼠显著降低（P＜0.05）。

表5 小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，血浆蛋白PAI⁃1和TM水平表达变化Tab.5 Changes in plasma protein PAI⁃1 and TM levels after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice±s

表5 小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，血浆蛋白PAI⁃1和TM水平表达变化Tab.5 Changes in plasma protein PAI⁃1 and TM levels after injection of lentivirus Clif interfering plasmids in mice±s

组别慢病毒转染组对照组P值例数11 11 PAI⁃1 41.10±7.32 48.09±12.13 0.045 TM 17.47±3.35 22.58±4.96 0.047

3 讨论

流行病学及时间生物学研究发现急性心肌梗死大部分发生于早晨，表明近日节律对心肌梗死的发生有重要的影响。已经报道的节律基因，如Bmal1与高血压发病密切相关［11-12］。神经内分泌系统表现出典型的近日节律振荡，肾素-血管紧张素系统在早晨功能表达升高。肾素-血管紧张素系统与血管内皮细胞收缩的近日节律性有关联。近日节律基因mPer2，dbp和Bmal1在鼠主动脉表现出明显的近日节律振荡，予以血管紧张素II会发现上述基因的表达增加［13-14］。另外，还有报道指出在急性心肌梗死动物心脏中mPer2，dbp，Bmal1和CLOCK基因表达水平明显升高［15］。通常情况下，心血管系统的近日节律变化的规律可反映出心血管系统正常与否。

本课题通过对节律基因Clif单核苷酸多态性与汉族人群AMI的关联分析，发现汉族人AMI患者的Clif基因rs2289709位点的基因型分布频率与对照组差异有统计学意义，提示Clif基因rs2289709位点与AMI存在密切关联。PAI⁃1是一种单链糖蛋白，当其以活性状态存在于血浆中时与血浆波基结合素结合，形成复合物提高其稳定性，当PAI⁃1活性存在时能有效的发挥其生理机能，降低血液的凝血倾向及血栓形成，防止血液在血管内形成血栓［16-17］。TM是位于血管内皮细胞膜表面的糖蛋白，它具有清除凝血酶、活化血液中抗凝因子蛋白C的作用，在抗凝因子蛋白C等的协同作用下能促进纤维蛋白的溶解从而降低血栓形成等作用［9，18］。PAI⁃1 和TM 是在凝血机制和血栓形成中发挥着重要作用的因子，当PAI⁃1和TM二者的功能失调时，将导致血凝和抗血栓功能失调，特别是PAI⁃1和TM的基因表达下调时，引起表达产生的PAI⁃1和TM减少，会造成抗凝血功能减弱，在血管中易形成血栓。

钟控基因产物之一PAI⁃1（血浆纤溶蛋白溶酶原激活抑制因子⁃1）在正常情况下表现出近日节律。OHKURA等［19］对近日钟基因突变小鼠的凝血和纤溶活性进行了研究，发现未突变小鼠在21：00纤溶活性最低；而在Clock突变小鼠中纤溶活性一直很低；进一步研究发现clock基因突变小鼠的PAI⁃1的近日节律消失；上述研究结果表明clock基因在调控PAI⁃1从而影响纤溶系统，进而使影响凝血系统扮演着重要的角色。基于上述结论，我们推测节律基因Clif对PAI⁃1同样具有调控作用。为此，本课题的深入研究通过小鼠体内注射慢病毒Clif干扰质粒后，观察干扰前后小鼠血浆中Clif、Pai⁃1和Tm基因mRNA表达变化。结果发现，小鼠体内射慢病毒Clif干扰质粒后，其血浆PAI⁃1和TM蛋白水平均较对照组小鼠显著降低。上述结果提示血浆PAI⁃1和TM亦受节律基因Clif的调控，Clif基因遗传变异可引起PAI⁃1和TM等钟控基因的节律消失，并造成血管中的血液易形成血栓。综上所述，本研究通过对节律基因Clif单核苷酸多态性与汉族人群AMI的关联分析，发现汉族人群中Clif基因rs2289709位点位点多态性与AMI存在明显关联。Clif基因表达下调将导致PAI⁃1和TM基因表达下调，从而引起血浆中PAI⁃1和TM水平下降，使血液易凝血而形成血栓。本研究结果也为阐释AMI常发生于清晨这一近日节律的现象提供了重要的实验依据。

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