微小RNA⁃758⁃3p在舌鳞状细胞癌细胞株中的表达及其对肿瘤细胞增殖和迁移的影响

王瑾 张梅君 李云峰 廖立凡湖北省第三人民医院口腔科（武汉430030）；西安交通大学口腔医学院、陕西省颅颌面精准医学研究重点实验室（西安70004）

舌鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤之一，常伴有早期淋巴结转移，恶性程度高［1］。基因水平的治疗已成为舌鳞状细胞癌研究的重要方向［2］。微小RNA（miRNA）是一类长度约为20～25个核苷酸的小分子非编码RNA，可引起下游基因mRNA的降解或抑制其翻译，调控细胞增殖、凋亡、衰老等生物学行为［3-4］。miR⁃758⁃3p是近年来新发现的miRNA，对miR⁃758⁃3p的研究报道较少。已有研究证实，miR⁃758⁃3p可在肝癌和宫颈癌中发挥肿瘤抑制作用［5-6］。本研究拟通过转染miR⁃758⁃3p至舌鳞状细胞癌细胞株，探讨miR⁃758⁃3p在舌鳞状细胞癌中的作用机制及对肿瘤细胞增殖和迁移能力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 RPMI1640培养基、DMEM⁃F12、高糖DMEM、DK⁃SFM和胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司。人舌鳞状细胞癌细胞株CAL27、HNl3、SCC15、TSCCA和人正常口腔黏膜细胞HOK购于中国科学院上海细胞生物所。Trizol试剂、反转录试剂盒和转染试剂LipofectamineTM2000试剂盒购于美国Invitrogen公司。引物购于南京金斯瑞公司。miR⁃758⁃3p 模拟物、miR⁃NC）、TRIM44野生型质粒（TRIM44⁃WT）和 TRIM44突变型质粒（TRIM44⁃MT）购于上海汉恒生物科技有限公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Pro⁃mega公司。一抗均购于美国BD公司。MTT试剂盒购于上海碧云天生物技术研究所。Transwell小室购于美国Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 CAL27细胞培养在10%FBS的高糖DMEM培养基，HNl3和TSCCA细胞培养在10%FBS的RPMI 1640培养基，SCC15细胞培养在10%FBS的DMEM⁃F12培养基，HOK细胞培养在DK⁃SFM培养基，培养条件为37℃、5%CO2的培养箱。取生长状态良好的TSCCA细胞接种到6孔板中，待细胞融合度达到60%～70%时，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，将miR⁃NC（对照组）或miR⁃758⁃3p（实验组）分别转染至TSCCA细胞。

1.2.2 RNA提取和qPCR检测 收集细胞，使用Trizol⁃氯仿-异丙醇法提取细胞总RNA，使用反转录试剂盒将2 μg总RNA反转为cDNA，PCR扩增检测得到循环阈值（Ct），采用 2⁃ΔΔCt法处理数据。以U6为内参检测miR⁃758⁃3p的表达，以GAPDH为内参检测TRIM44 mRNA的表达。

1.2.3 生物信息学预测及双荧光素酶报告基因验证 microRNA.org软件预测显示，miR⁃758⁃3p与TRIM44之间存在较好的碱基互补配对关系，见图1。将对数期的TSCCA细胞接种于6孔板，待细胞融合度为60%～70%，分别进行转染。转染48 h后，严格根据双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行操作，检测各组荧光素酶活性。

1.2.4 Western blot检测TRIM44蛋白的相对表达量 收集各组细胞，裂解液裂解细胞收集蛋白，通过SDS⁃PAGE凝胶电泳分离蛋白，转移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，封闭后加入一抗4°C下孵育过夜，室温下二抗孵育1 h，增强型化学发光试剂（ECL）发光液显影。

表1 qPCR引物序列Tab.1 qPCR primer sequences

图1 miR⁃758⁃3p与TRIM44 3′⁃UTR互补配对的序列Fig.1 Sequence of miR⁃758⁃3p complementary binding to TRIM44 3′⁃UTR

1.2.5 流式细胞术检测细胞周期分布 收集各组细胞，预冷的70%乙醇溶液重悬固定过夜，100 mg/L RNase A重悬，在37°C水浴孵育15 min，加入含50 mg/L碘化丙啶溶液的PBS缓冲液500 μL，4℃避光孵育15 min，流式细胞仪检测各组的细胞周期分布。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖能力 收集各组细胞，以5×103个/孔接种于96孔板中，每组设4个复孔。于1、2、3、4和5 d时分别取各时段的细胞，每孔加入20 μL MTT溶液，培养箱内培养4 h，离心弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），酶标仪检测每孔光密度OD值。

1.2.7 Transwell法检测细胞迁移能力 收集各组细胞，以2×104/孔接种于Transwell上室，下室加入600 μL含血清的培养基，培养箱内培养24 h。棉签擦去上室内未穿过孔膜的细胞，使用1 mL 4%多聚甲醛固定10 min，使用1 mL 0.1%结晶紫染色15 min，显微镜下观察计数穿膜细胞数。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件进行组间数据比较分析，计量资料用均值±标准差表示，两组独立样本均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 人舌鳞状细胞癌细胞株中miR⁃758⁃3p的表达 qPCR结果显示，人舌鳞状细胞癌细胞株CAL27、HNl3、SCC15、TSCCA和人正常口腔黏膜细胞HOK细胞中miR⁃758⁃3p的相对表达量分别为：0.51±0.06、0.64±0.11、0.57±0.09、0.28±0.13和1.00 ± 0.09，miR⁃758⁃3p在舌鳞状细胞癌细胞中的表达水平明显低于其在正常口腔黏膜细胞中的表达，差异有统计学意义（P＜0.05）。TSCCA细胞中miR⁃758⁃3p表达水平最低，故以TSCCA细胞为后续研究模型。

2.2 qPCR检测转染后细胞中miR⁃758⁃3p和TRIM44 mRNA的表达 qPCR结果显示，实验组和对照组TSCCA细胞中miR⁃758⁃3p的相对表达量分别为63.89±11.24和1.09±0.47（P＜0.01）。实验组TSCCA细胞中TRIM44 mRNA的相对表达量明显低于对照组（P＜0.05）。

2.3 miR⁃758⁃3p与TRIM44的靶向关系 构建野生型和突变型的TRIM44真核表达载体。双荧光素酶报告基因检测显示共转染miR⁃758⁃3p+TRIM44⁃WT的TSCCA细胞荧光活性显著下降（P＜ 0.01，图2）。

图2 各组TSCCA细胞中荧光素酶活性的比较Fig.2 Comparison of luciferase activity in TSCCA cells of two groups

2.4 过表达miR⁃758⁃3p下调TSCCA细胞中TRIM44蛋白表达 Western blot检测结果显示，实验组TSCCA细胞中TRIM44蛋白的表达量明显低于对照组，mTOR磷酸化水平降低，细胞周期相关蛋白CDK4和Cyclin D1蛋白表达降低，上皮间充质转化（EMT）的上皮表型β⁃catenin蛋白表达升高，间质表型Vimentin蛋白表达降低（图3）。

2.5 过表达miR⁃758⁃3p抑制TSCCA细胞周期进展 流式细胞术检测结果显示，转染miR⁃758⁃3p后，TSCCA细胞在G0/G1期的细胞比例明显升高（P＜ 0.01），表明miR⁃758⁃3p可抑制TSCCA细胞周期进展。

2.6 过表达miR⁃758⁃3p抑制TSCCA细胞的增殖活性 MTT检测结果显示，转染miR⁃758⁃3p后，TSCCA细胞由第4天开始，增殖活性显著低于对照组（P＜0.01，图4）。

图3 miR⁃758⁃3p对TSCCA细胞中TRIM44蛋白及下游蛋白表达的影响Fig.3 Effect of miR⁃758⁃3p on the expression of TRIM44 protein and downstream proteins in TSCCA Cells

Fig.4 The proliferative activity of TSCCA cells in two groups was detected by MTT图4 MTT检测两组TSCCA细胞的增殖活性

2.7 过表达miR⁃758⁃3p对TSCCA细胞的迁移能力的影响 Transwell迁移实验结果显示：实验组TSCCA细胞的穿膜细胞数［（34.11±7.33）个］明显低于对照组组［（71.56±14.26）个］，差异有统计学意义（P＜ 0.01），表明过表达miR⁃758⁃3p可抑制TSCCA细胞的迁移能力。

3 讨论

基因靶向治疗是近年来舌鳞状细胞癌防治研究的热点［7］。miRNA通过在转录后水平调节相关下游的基因表达，影响肿瘤细胞的增殖和转移，具有癌基因和抑癌基因的作用［8-10］。有研究［5］显示，miR⁃758⁃3p在肝癌组织及其细胞株内表达均降低，转染miR⁃758⁃3p后可显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR⁃758⁃3p在其他肿瘤如舌鳞状细胞癌的功能及作用机制尚不清楚。

本研究中，qPCR结果显示miR⁃758⁃3p在舌鳞状细胞癌细胞株中的表达明显下调，表明miR⁃758⁃3p可能参与舌鳞状细胞癌细胞的发生、发展。通过microRNA.org软件预测及双荧光素酶报告基因验证miR⁃758⁃3p的下游基因是三结构域蛋白44（TRIM44）。TRIM44是三结构域蛋白（TRIM）家族成员之一，是细胞生物学功能的关键调节因子，在肿瘤的形成和进展中发挥重要作用［11］。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是细胞增殖、迁移和侵袭等多种细胞功能的关键调节因子［12］。TRIM44能通过mTOR信号通路促进肿瘤的转移和增殖［13］。Western blot结果显示，miR⁃758⁃3p 下调TRIM44蛋白表达后，TSCCA细胞中mTOR的磷酸化水平明显降低，细胞周期相关蛋白CDK6和Cyclin D1蛋白表达下降，上皮细胞表型β⁃catenin蛋白表达升高，间质细胞表型Vimentin蛋白表达下降。过表达miR⁃758⁃3p可明显抑制舌鳞状细胞癌细胞株细胞周期的进展，降低细胞增殖能力，抑制细胞的迁移能力。

本研究结果显示，miR⁃758⁃3p在舌鳞状细胞癌细胞株中低水平表达，可通过抑制TRIM44基因的表达，干扰mTOR信号通路的转导，抑制舌鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移。miR⁃758⁃3p可能为舌鳞状细胞癌的分子治疗提供了新的靶点。

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