胚胎干细胞培养与鉴定的方法研究

宁芳 陈光

胚胎干细胞是来源于着床前囊胚期的内细胞团或早期胚胎原始生殖嵴的原始生殖细胞的一种多潜能细胞，具有体外无限增生和高度自我更新的能力，在一定条件下，能分化成3个胚层来源的各种细胞[1，2]。因此，胚胎干细胞在动物和人的胚胎发育、致畸实验、组织工程和移植治疗等研究领域具有重要的科学意义和巨大的应用前景[3]。现已经证明小鼠胚胎干细胞可以分化为心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞、骨髓细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞等[4]。然而胚胎干细胞能否向牙源性上皮方向转化在国内还未见报道。在本实验中，我们对小鼠的胚胎干细胞R1系及CGR8系进行了原代培养及传代，并进行了体内外的鉴定，为下一步探讨胚胎干细胞替代牙源性上皮细胞的研究奠定基础。

资料和方法

1.细胞来源：胚胎干细胞R1系及CGR8系源自中国科学院广州生物医药与健康研究院。

2.实验动物：6周龄免疫缺陷小鼠（第四军医大学实验动物中心）。

3.主要试剂：高糖DMEM/F12 培养基（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；无钙镁 PBS（Gibco，美国）；谷氨酰胺（Gibco，美国）；2-巯基乙醇（Gibco，美国）；I型胶原酶（Sigma，美国）；丙醇酸钠（Gibco，美国）；Dispase（Sigma美国）；非必须氨基酸（Gibco，美国）；青链霉素（Gibco，美国）；ALP试剂盒（Millipore，美国）；白血病抑制因子（Gibco，美国）；0.25%胰蛋白酶（Sigma美国）；抗小鼠一抗：OCT4（Santa Cruz Biotechnology， 美 国）；SSEA4（Santa Cruz Biotechnology，美国）；FITC 或 Rhodamine标记的兔抗羊或羊抗兔二抗（Santa Cruz Biotechnology，美国）。

4.主要仪器：低温高速离心机（北京医用离心机厂）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympas，日本）；二氧化碳恒温孵箱（Forma，美国）；YJ-875型超净工作台（苏州净化设备厂）；细胞筛网（Falcon，USA）；不锈钢高压锅（苏泊尔）；培养板（Falcon，美国）；滤器（Corrigtwohill，爱尔兰）。

5.胚胎干细胞的培养：①复苏：首先从液氮中取出一支冻存管的胚胎干细胞，放入37℃水浴中晃动，直到只剩下小冰晶。吸取冻存管内的细胞悬液加至有少量培养液的15ml离心管中，离心1000rpm，5分钟。吸弃上清液，加4～6ml培养液，吹打悬浮。接下来重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。随后转移到一个已经铺好饲养层的25cm2培养瓶中培养并每天换液。②传代：一般在复苏后第2～3天传代，视克隆的大小和密度而定。首先吸弃废液，用PBS（不含钙镁）轻轻冲洗两遍，之后加0.5～1.0ml的胰酶（0.25%）-乙二胺四乙酸（0.02%）溶液至培养瓶，左右晃动，使胰酶覆盖整个瓶底，消化细胞。在显微镜下观察，直到细胞层全部脱落（一般需要1～2分钟）。随后加适量（4～5ml）含血清的培养液终止消化。建议专门配制只含85%DMEM+15%DFBS的终止液，来终止胰酶的作用即可，因为如果用mES培养液，其中还含有LIF、L-谷氨酰胺、NEAA、β-巯基乙醇这些昂贵的成分，而终止胰酶主要是靠血清细胞，制成单细胞悬液，并加足量的培养液，吹打混匀，细胞液分装到25cm2培养瓶中，一个培养瓶内加5～6ml ES培养液，放入培养箱中。确保每天换液，传代比例：1：4～1：10或者更大。

培养液配方250ml的培养液中含有210ml的高糖DMEM、37.5ml的灭活胎牛血清、2ml的非必须氨基酸、0.25ml的丙醇酸钠及0.25ml的2-巯基乙醇。每次换液时加入LIF，换多少液加入相应量LIF。

6.碱性磷酸酶染色：将小鼠胚胎干细胞接种于明胶预处理的盖玻片上培养2天。将培养后的细胞用4%多聚甲醛固定15分钟，蒸馏水洗3次，5分钟/次。碱性磷酸酶染色液37℃避光作用15分钟，蒸馏水洗2次，5分钟/次。放入无水乙醇ⅰ中10分钟，无水乙醇ⅱ中10分钟，二甲苯中20分钟，树胶封固，拍照。

7.拟胚体的形成：胚胎干细胞通过悬滴法可以形成具有三胚层结构的拟胚体（EBs）。拟胚体因与胚胎的早期发育相似，被广泛用于研究器官的发育以及不同胚层间的相互作用。成为研究干细胞进展重要的技术手段。

EB的制备：首先消化细胞，计数。将浓度调至12～16万个细胞/毫升后进行悬滴。以25μL一滴，均匀的滴至六孔板的上盖内表面。悬滴间距应适中。滴满后的上盖迅速扣至已经事先加入少量PBS 的六孔板上，随后小心放置孵箱中。2天后，在每一个悬滴液体中均可以看见一个白色点状物，即为拟胚体。小心地将拟胚体吸出后进行随后的实验。

8.裸鼠体内移植：将2×106细胞用300μL不含LIF的培养基重悬，随即注射入裸鼠皮下，移植4周后取材。

9.裸鼠皮下移植物检测：体内移植4周后取材，首先用多聚甲醛固定移植物约24h，之后用脱钙液脱钙直至触摸至柔软状，流水冲洗后石蜡包埋并进行HE染色。

结 果

1.胚胎干细胞的形态学观察：胚胎干细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞核大，有一个或几个核仁，胞核中多为常染色质，胞质胞浆少，结构简单。体外培养时，细胞排列紧密，呈集落状生长，呈一个个克隆团样（图1A）。细胞克隆团和周围存在明显界限，形成的克隆细胞彼此界限不清，细胞表面有折光较强的脂状小滴。细胞克隆形态多样，多数呈岛状或巢状。小鼠胚胎干细胞的直径约为7μm～18μm，在LIF存在的情况下可以一直处于未分化状态，细胞的增值能力快。

2.胚胎干细胞的体外鉴定结果：未分化的胚胎干细胞生物学特性为表达阶段特异性胚胎抗原-4（SSEA4），OCT4，及碱性磷酸酶，体外在一定条件下能生成拟胚体等。本实验中用碱性磷酸酶染色后，胚胎干细胞呈棕红色。说明碱性磷酸酶染色阳性，细胞处于未分化状态（图1B）。

悬滴法培养2天后即可生成拟胚体（图1C），镜下观察拟胚体的周缘光滑，聚集紧密，为正圆形态，易于计算直径。

图1 胚胎干细胞的培养及体外鉴定（A：未分化的胚胎干细胞 B：碱性磷酸酶染色 C：悬滴法生成的拟胚体）

3.胚胎干细胞的体内鉴定结果：将胚胎干细胞离散制成悬液，以适当剂量注射到裸鼠皮下，4周后取材可见有混合组织瘤形成（图2）。大体观较大的畸胎瘤直径有2个厘米，生长速度很快，在植入约2周后迅速生长。组织切片HE染色结果显示：镜下可观察到上皮组织（外胚层结构），软骨组织（中胚层结构）及内脏组织（内胚层结构）生成（图3），三胚层的组织进一步验证了畸胎瘤的结果。本实验培养的R1系及CGR8系在细胞的形态、体内外的生物学特性方面无显著差异，在细胞增值能力方面R1系较强，因此在随后对胚胎干细胞的诱导实验中我们将使用R1系的胚胎干细胞。

图2 畸胎瘤大体标本图

图3 体内形成畸胎瘤HE染色结果[A：上皮角化物（外胚层）；B：软骨组织（中胚层）；C：内脏组织（内胚层）]

讨 论

胚胎干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的全能干细胞[4]。未分化的胚胎干细胞不仅从形态学上成克隆团样生长，而且还具有碱性磷酸酶染色阳性、能形成具有3个胚层结构的拟胚体及特异性胚胎抗原SSEA4及OCT4表达阳性。体内可以形成畸胎瘤[5～8]。

胚胎干细胞极易受外界因素的影响，对生长条件要求非常苛刻[9]。常规的胚胎干细胞培养液中含有高糖MEM培养基、胎牛血清、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇和非必需氨基酸等，为了防止胚胎干细胞发生分化，还要在培养液中加入白血病抑制因子（LIF），胎牛血清的质量及浓度也是影响ES细胞生长状况的重要因素。

拟胚体是广泛应用于干细胞研究的一种途径，而目前关于形成拟胚体方法的研究彼此相差很大[10～12]。在本实验形成拟胚体的过程中我们通过比较各种条件后发现以15万个细胞/mL悬滴48小时生成拟胚体的方法最理想。因为在这种条件下生成的拟胚体大小一致，形态规则。我们使用R1和CGR8这两种细胞系多次重复，结果一致。虽然有学者认为，即使刚生成的拟胚体大小不同，但经过培养后，分化程度不会有很大差别。但是我们仍然推荐这个浓度，因为当大于这个浓度悬滴时，培养液会由于细胞的量大而发黄，提示培养液中没有足够的养分提供给全部的胚胎干细胞。由于培养液的PH值也发生了变化，对拟胚体的早期形成不利。此外，当以小于这个浓度悬滴时，由于在消化中胰酶的作用会引起部分细胞的死亡，而在细胞计数时这些细胞也在计算中。如果悬滴细胞达不到一定的浓度，则在规定时间内就不能形成拟胚体。换言之，细胞的浓度低后就需要更长的时间来形成较为成熟的拟胚体。因此，我们认为15万个细胞/mL悬滴48小时是最优化的实验条件。

胚胎干细胞在体内可以形成三胚层的畸胎瘤，充分说明了它的多向分化潜能。胚胎干细胞体内外的多向分化潜能为下一步诱导其向牙齿上皮方向转化提供了依据。但是如果胚胎干细胞未分化完全，则在体内可以形成畸胎瘤，这为胚胎干细胞在应用方面带来很大障碍，因此在实验中探索胚胎干细胞诱导分化的同时如何提高诱导效率也是后续研究的重点。

参考文献

1 Bianco P，Robey PG.Stem cells in tissue engineering.Nature，2001，414（6859）：118-121.

2 Chai Y，Slavkin HC.Prospects for tooth regeneration in the 21st century：a perspective.Microsc Res Tech， 2003， 60（5）：469-479.

3 Hu B，Unda F，Bopp-Kuchler S，et al.Bone marrow cells can give rise to ameloblast-like cells.J Dent Res，2006，85（5）：416-421.

4 Petrovic V，Stefanovic V.Dental tissue-new source for stem cells.Scientific World Journal，2009，9：1167-1177.

5 Bourne S，Polak JM，Hughes SP，et al.Osteogenic differentiation ofmouse embryonic stem cells：differentialgene expression analysis by cDNA microarray and purification of osteoblasts by cadherin-11 magnetically activated cellsorting.Tissue Eng，2004，10（N5-6）：796-806.

6 Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.Science，1998，282（N5391）：1145-1147.

7 Heng BC，Cao T，Stanton LW，et al.Strategies for directing the differentiation of stem cells into the osteogenic lineage in vitro.J Bone Miner Res，2004，19（9）：1379-1394.

8 Deutsch G，Jung T，Zheng M，et al.A bipotential precursor population for pancreas and liver within the embryonic endoderm.Development，2001，128（6）：871-881.

9 Duncan SA.Mechanisms controlling early development of the liver.Mech.Dev，2003，120（1）：19-33.

10 Young CS，Terada S，Vacanti JP，et al.Tissue engineering of complex tooth structures on biodegradable polymer scaffolds.J Dent Res，2002，81（10）：695-700.

11 Nakao K，Morita R，Saji Y，et al.The development of a bioengineered organ germ method.Nat Methods，2007，4（3）：227-230.

12 Tucker A，Sharpe P.The cutting-edge of mammalian development;how the embryo makes teeth.Nat Rev Genet， 2004， 5（7）：499-508.