可生物素化HLADRB1*07：01蛋白的原核表达和纯化

李敏英 李文 陶爱林

广州医科大学附属第二医院，广东省过敏反应与免疫重点实验室/呼吸疾病国家重点实验室（广州510260）

抗原提呈细胞（antigen⁃presenting cell，APC）摄取抗原并将其处理成免疫原性多肽，以抗原肽⁃MHC分子复合物的形式表达于APC表面，供T细胞表面（T cell receptor，TCR）识别［1］，CD4+T细胞通过识别MHCⅡ⁃肽复合物而被激活，调节或者协助细胞免疫及体液免疫，在免疫应答中起非常重要的作用，检测抗原特异性CD4+T细胞的传统手段有酶联免疫斑点法（ELISPOT）和有限稀释法（LDA）等，但灵敏度较低。1996年，ALTMAN等［2］建立MHC⁃肽四聚体的实验技术，利用MHC⁃肽四聚体成功地通过流式细胞仪在单个细胞水平上检测特异性T细胞，为定量检测特异性T细胞提供了新的有效手段。

据报道［3-5］，HLA⁃DRB1*07：01与天冬酰胺酶的超敏反应相关，携带HLA⁃DRB1*07：01基因型的人群有较高的风险对天冬酰胺酶过敏。对此，我们可以利用MHCⅡ⁃四聚体这一技术来体外确定HLA-DRB1*07：01与对天冬酰胺酶高亲和力的表位肽，制备重组的表位肽疫苗，或通过突变把高亲和力表位肽改造成低亲和力肽，降低患者对天冬酰胺酶的免疫应答，也用于特异性免疫治疗。此外，在对HLA⁃Ⅱ的研究中发现，HLA⁃DRB1*07：01这一基因型与许多疾病有关，比如白癜风［6-8］、拉帕替尼（用于晚期或转移性乳腺癌的治疗）诱导的肝损伤［9-11］、银屑病［12-14］等疾病相关，以及据本实验室的生物信息学分析发现，多种过敏原与HLA⁃DRB1*07：01的亲和力均较强，与对应的过敏性疾病相关度高。因此，HLA⁃DRB1*07：01的表达纯化和其MHC⁃Ⅱ四聚体的制备，对这些相关疾病的研究具有重要的意义和价值。

为使MHCⅡ的α亚基和β亚基可在体外二聚化，形成结构完整的MHCⅡ蛋白。本文在2个亚基跨膜区加入亮氨酸拉链，亮氨酸拉链是由伸展的氨基酸组成，每7个氨基酸残基中的第7个氨基酸是亮氨酸，亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在螺旋的一侧，所有带电荷的氨基酸残基排在另一侧。当2个蛋白质分子平行排列时，亮氨酸之间相互作用形成二聚体，形成“拉链”。为了获得生物素化的MHCⅡ，在β链跨膜区加入Avi标签，其由15个氨基酸残基（GLNDIFEAQKIEWHE）组成，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，融合表达后，可被生物素连接酶（如BirA）生物素化，可用于蛋白质分离纯化和蛋白质相互作用研究。无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化。

1 材料与方法

1.1 材料DNA marker、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ购自TaKaRa公司，表达载体pET44a为实验室保存，pETduet⁃1购自长沙爱科博生物科技有限公司，蛋白marker购自Thermo公司，T4连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司，Agarose购自上海海生公司，PVDF膜购自Millipore公司，兔抗HLA⁃DRA抗体购自Sigma公司（货号：HPA050162⁃100 UL），辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体购自CST公司（货号：7074S），辣根过氧化物酶标记的链霉素抗体购自Abcam公司（货号：ab7403），测序公司为广州擎科生物技术有限公司，封闭液：5%脱脂奶粉，PBS溶解，包涵体洗液含100 mmol/L Tris⁃HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，0.5%Triton X⁃100，pH 8.0。

1.2 HLA质粒的构建从Genbank中获得HLA⁃DRB1*07：01的cDNA序列，人工合成基因片段时，α链、β链的跨膜区加入亮氨酸拉链，其中β链还在跨膜区加入Avi标签。利用NdeⅠ和XhoⅠ将含目的基因HLA α链、β链的质粒和表达载体pET44a、pETduet⁃1⁃BirA双酶切，PCR鉴定后，使用T4 DNA连接酶将HLA α链、β链分别构建于表达载体pET44a和pETduet⁃1⁃BirA上，然后转至JM109中，于含有Amp的LB固体培养基涂平板，37℃过夜后，挑取单菌落做菌落PCR鉴定，α链的上游引物P1：5′⁃CATATGATCAAAGAAGAACATGTG⁃3′，下游引物P2：5′⁃CTCGAGTTATTAAGCAGCCAGGATG⁃3′，β链的上游引物 P3：5′⁃CATATGGGGGACACCCA⁃ACC⁃3′，下游引物 P4：5′⁃CTCGAGTTATTAATTGT⁃GCC⁃3′，BirA 的上游引物P5：5′⁃CGCGGATGAAG⁃GATAACACCGTG⁃3′，下游引物P6：5′⁃ACGCGTCG⁃ACTTATTTTTCTGCACTACG⁃3′，然后将阳性菌落接种于LB含Amp的液体培养基中，37℃摇（200 r/min）过夜后用于提取质粒和公司测序。

1.3 HLA的诱导表达将上述含有正确目的基因的 pET44a⁃HLA α链和 pETduet⁃1⁃HLA β链⁃BirA质粒分别转化至表达菌株Rosetta中后，接种于含Amp的LB琼脂平板中，37℃过夜后挑选阳性克隆后，在接种于含Amp的LB液体培养基中，按1∶50的量加入20%的葡萄糖，37℃摇菌至菌液OD600nm值约为0.6～0.8时，分别加入IPTG至终浓度为0.25 mmol/L，其中HLA β链的诱导需加入0.5 mmol/L生物素，37℃，200 r/min摇菌，诱导4 h后，各个收集1 mL菌液，10 000g，2 min离心后，去掉上清，制样后沸水煮10 min，离心后SDS⁃PAGE电泳，浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为12%。

1.4 Western印迹鉴定HLA蛋白将上述样品制样电泳后，将凝胶上的条带转至PVDF膜上，转膜后都加入封闭液室温孵育1 h，封闭后HLA α链加入的一抗为兔抗HLA⁃DRA，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，HLA β链只需孵育辣根过氧化物酶标记的链霉素抗体。

1.5 HLA蛋白的可溶性分析及纯化将诱导后的菌体收集后，以 100 mmol/L Tris⁃HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA重悬，在冰浴中超声裂解菌体。离心后分别收集上清和沉淀，利用SDS⁃PAGE电泳分析目的蛋白的可溶性后，用洗液洗涤包涵体3次，每次4℃搅拌30 min，在用不含TritonX⁃100的洗液洗1遍，最后再用6 mol/L尿素（含100 mmol/L Tris⁃HCl，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA）变性溶解，通过SDS⁃PAGE分析各管组分。

2 结果

2.1 重组质粒的构建将含有目的基因的质粒经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切和PCR鉴定大小正确（图1、2）后，切胶回收，将HLA α链的基因片段连接到pET44a载体上，β 链的基因片段连到 pETduet⁃1⁃BirA上，转入大肠杆菌JM109，涂板过夜后挑取单菌落做PCR鉴定，α链PCR产物电泳结果显示在约750 bp，BirA的显示约100 bp，β链的显示在约750 bp处有特异性条带扩增，大小均与目的基因相符，结果显示重组质粒构建成功（图3、4）。

图 1 pUC57⁃HLA⁃DRB10701 α链双酶切Fig.1 Identification of pUC57⁃HLA⁃DRB10701 α chain by digestion

图2 pET44a⁃1⁃HLA⁃DRB10701 β链双酶切Fig.2 Identification of pET44a⁃1⁃HLA⁃DRB10701 β chain by digestion

图3 pET⁃44a⁃HLA⁃DRB10701 α链的PCR鉴定Fig.3 Identification of pET⁃44a⁃HLA⁃DRB10701 α chain by PCR

图4 pETduet⁃1⁃HLA⁃DRB10701 β 链⁃BirA的PCR 鉴定Fig.4 Identification of pETduet⁃1⁃HLA⁃DRB10701 β chain⁃BirA by PCR

2.2 目的基因的诱导表达将含有目的基因的重组质粒转入表达菌株Rosetta中，均加入终浓度为0.25 mmol/L的IPTG诱导4 h，取部分菌液制样进行SDS⁃PAGE凝胶电泳，结果显示加入IPTG后成功诱导表达分子量分别为34和29 kD，其分子量与目标蛋白的大小相符（图5A、6A）。

2.3 Western印迹鉴定目的蛋白将诱导后的菌液制样，经SDS⁃PAGE电泳后转印至PVDF膜上，α链用兔抗HLA⁃DRA抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体为二抗，ECL显色。生物素化的β链用辣根过氧化物酶标记的链霉素孵育，ECL显色。结果显示HLA⁃DRA和链霉素均可分别与目的蛋白结合，而未经诱导的菌液作为阴性对照，未见有结合条带（图5B、6B）。

2.4 目的蛋白的可溶性分析及纯化菌体收集后，冰上超声裂解，离心后分别取上清和沉淀制样，利用SDS⁃PAGE电泳分析发现目的蛋白不溶（图7），主要为包涵体表达，收集包涵体后洗涤3次，最后用6 mol/L尿素溶解得到变性蛋白。通过SDS⁃PAGE电泳分析蛋白纯化效果，可见纯化后蛋白纯度较高（图8）。

图5 HLA⁃DRB10701 α链的诱导表达与Western blot分析Fig.5 Expression of HLA⁃DRB10701 α chain and Western blot analysis

图6 可生物素化HLA⁃DRB10701 β链的诱导表达与Western blot分析Fig.6 Expression of Biotinylated HLA⁃DRB10701 β⁃chain and Western blot Analysis

图7 重组HLA⁃DRB10701的可溶性分析Fig.7 Soluble analysis of recombinant HLA⁃DRB10701

图8 纯化前后HLA⁃DRB10701的SDS⁃PAGE电泳分析Fig.8 Analysis of HLA⁃DRB10701 by SDS⁃PAGE before and after purification

3 讨论

MHCⅡ是由α链和β链组成的异源二聚体，2条链分别由HLAⅡ类α和β基因编码，均具有多态性。2条多肽链的基本结构相似，氨基端在胞外，羧基端在胞内，胞外部分占整条链的2/3。α链和β链胞外部分可再分为2个结构域，称为α1、α2和β1、β2，其中α1和β1构成肽结合槽，锚合抗原呈递细胞（APC）中外源性抗原短肽，形成MHCⅡ类分子-肽复合物，转运到细胞表面，与特异性CD4+T细胞表面的TCR结合，激活并使之发挥作用。

在早期许多学者对MHC分子体外结合多肽的研究没有取得较好的效果，其原因之一是单个MHC⁃肽复合物（pMHC）与TCR的结合亲和力低、解离速度快。而ALTMAN等［2］在研究中发现四分子的pMHC与TCR具有较强的亲和力。MHCⅡ⁃肽四聚体是在Ⅱ类分子β链跨膜区及胞内区位置被末端带有BirA酶底物肽（Avi）的亮氨酸拉链（leucine zipper motif）替代，诱导表达时加入生物素，利用BirA酶使其体内生物素化，再与α链、抗原肽折叠，形成可溶性MHC⁃肽单体分子，加入适当比例的链霉亲和素，即可获得稳定的四聚体［15］。与现有的研究［16］在体外生物素化相比，本文在体内实现生物素化，具有更方便快捷，并减少不必要的实验步骤就可实现生物素化的好处。

本实验选用 pET⁃44a和 pETduet⁃1 表达载体，分别构建表达载体 pET⁃44a⁃HLA⁃DRB1*07：01 α链和 pETduet⁃1⁃HLA⁃DRB1*07：01 β 链⁃BirA 转化至Rosetta中，经IPTG诱导表达。SDS⁃PAGE电泳分析发现目的蛋白主要存在于包涵体中，可以抵抗宿主细胞内的蛋白质酶的攻击，免于大量降解。通过反复洗涤包涵体，去除大量可溶性杂蛋白，获得高纯度目的蛋白。此外，可参照AYYOUB等［17］设计含有一个His标签的抗原肽，与MHCⅡ分子孵育后，利用亲和层析获得抗原肽与MHCⅡ分子形成稳定的pMHC单体。可生物化重组表达蛋白HLA⁃DRB1*07：01的表达与纯化，为进一步制备HLA⁃肽四聚体奠定了实验基础。

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