CCT8在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

盖领 茅国新 吴锦伟 吕丽婷 姚宁华 陈洁

1南通大学附属医院肿瘤化疗科（江苏南通 226001）；2南通大学医学院（江苏南通 226001）；3南通大学附属医院放疗科（江苏南通 226001）；4江阴市人民医院肿瘤科（江苏江阴 214400）

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，主要病理类型包括非小细胞肺癌（non⁃small⁃cell lung cancer，NSCLC）和小细胞肺癌（small⁃cell lung cancer，SCLC）两大类，其中NSCLC占80%左右。由于接近75%的肺癌患者在疾病诊断时已经处于晚期或伴有转移，因此对于这部分患者化疗是主要的有利治疗手段。尽管近年来肺癌化疗取得了长足的进步，但其5年生存率仅为15%［1-2］。分子伴侣家族是一类在细胞内能够协助其他多肽进行折叠、组装、转运、降解的蛋白，并在DNA的复制、转录、细胞骨架功能、细胞内的信号转导等领域发挥着重要的生理作用［3］。CCT属于Ⅱ型伴侣素，是目前真核细胞胞浆中发现的唯一伴侣素，CCT8（chaper⁃onin containing TCP1，subunit 8）是CCT家族中的一个分子亚型。越来越多的实验数据报道CCT8在肠癌、胶质瘤和原发性肝癌中异常表达［4-5］，但在肺癌中尚未见报道。本研究通过免疫组化及蛋白免疫印迹法检测NSCLC组织中CCT8的表达，并分析其与NSCLC临床病理学特征以及预后的关系，研究CCT8对NSCLC发生、发展及预后的影响，以期能为NSCLC提供新的治疗方法。

1 资料与方法

1.1 组织标本NSCLC石蜡标本140例，由南通大学附属医院病理科提供。标本均为2005-2009年手术切除标本，病理诊断明确，并且有完整的临床病理学随访资料。患者年龄介于44～83岁；肿瘤直径≤3 cm者48例，肿瘤直径＞3 cm者92例；组织学分型：鳞癌91例，腺癌37例，鳞腺癌12例；组织学分级：1级13例，2级69例，3级58例；有淋巴结转移者60例，无转移者80例。

1.2 蛋白电泳法收集NSCLC组织和癌旁组织，提取蛋白进行SDS⁃PAGE电泳，分别加入兔抗人CCT8多克隆抗体（1∶1 000，Santa cruz公司），GAP⁃DH兔抗人多克隆抗体（1∶1 000，Santa cruz公司）；NBT/BCIP显色，自动凝胶分析仪照相，分析NSCLC组织和癌旁组织中CCT8、Ki⁃67和GAPDH蛋白的表达。

1.3 免疫组化染色石蜡包埋组织60℃（于电热恒温干燥箱内，下同）烤片6～8 h。二甲苯15 min×3次（60℃）后用低浓度梯度的乙醇水化，自来水冲洗片刻。利用0.01 mol/L柠檬酸缓冲液（PH 6.0）及高压锅进行抗原修复。自然冷却后用3%H2O2孵育10 min以阻断内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次。滴加一抗，兔抗人CCT8多克隆抗体（1∶1 000），鼠抗Ki⁃67（1∶500），室温孵育2 h。使用PBS作为阴性对照。0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次，擦干后滴加组化二抗，室温孵育。0.01 mol/L PBS冲洗3 min×3次后DAB显色，苏木素复染，高浓度梯度的乙醇脱水，中性树脂封片。

1.4 阳性结果判断采用双盲法光镜下观察结果。每片随机观察5个高倍视野（×200倍）。CCT8蛋白的表达定位在细胞浆，结果评判标准：按肿瘤阳性细胞率和着色强度分别进行计分：（1）按阳性细胞百分率：0分（阴性）、1分（10%以下）、2分（10～50%）和3分（50%以上）。（2）按着色计分：分为4个等级，0分（阴性）、1分（淡棕色）、2分（棕色）和3分（深棕色）。2种记分的乘积为检测的表达状况，总分＜3分为低表达，≥3分为高表达。Ki⁃67蛋白表达以细胞核出现棕黄色染色颗粒为阳性，Ki⁃67胞核染色按肿瘤阳性细胞率20%分为：≤ 20%为低表达，＞ 20%为高表达［6］；所有切片均由2位经验丰富的病理专家单独阅片。

1.5 随访本组全部140例NSCLC患者均从病理确诊时开始计算生存时间，以电话形式进行随访，随访时限为5年，随访率100%。

1.6 统计学方法运用SPSS 18.0统计分析软件进行分析。对CCT8和K⁃i67蛋白在NSCLC中的表达与相应的临床病理学特征之间的关系采用χ2检验，Kaplan⁃Meier生存曲线和 log⁃rank检验分析生存数据，使用Cox比例风险模型进行多因素分析，并记录每个数据的危险比和95%可信区间。P＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCT8蛋白在NSCLC组织和癌旁组织中表达蛋白印迹结果显示：在NSCLC组织中，CCT8呈高表达，在癌旁组织中表达相对较低（图1）。

图1 蛋白免疫印迹实验检测3对NSCLC组织中CCT8的表达Fig.1 The expression of CCT8 in 3 paired NSCLC tissues by Western blot

2.2 NSCLC石蜡切片组织中CCT8的表达免疫组化结果显示CCT8在人NSCLC组织中高表达，表达主要定位于细胞浆，染色呈棕褐色。Ki⁃67在NSCLC中高表达，主要表达在细胞核中，染色呈棕黄或棕褐色（图2）。

2.3 CCT8的表达与患者临床病理学特征的关系根据CCT8在NSCLC组织中的表达水平，将其分为高表达组和低表达组，分析CCT8的表达与NSCLC患者临床病理学特征之间的关系。结果显示CCT8的表达强度与NSCLC患者组织学分级（P=0.001）、临床分期（P=0.015）、淋巴结转移（P=0.005）和Ki⁃67（P=0.0014）有关，差异有统计学意义，与患者的年龄、性别、吸烟、组织学分型及肿瘤大小无关（表1）。

2.4 CCT8蛋白表达与预后的关系根据COX回归分析显示，CCT8（P=0.013）、淋巴结转移（P＜0.001）和Ki⁃67（P=0.012）均与预后相关（表2）。经Kaplan⁃Meier分析发现，NSCLC患者中CCT8的低表达和高表达者的中位生存期分别为41个月和27个月，结果显示：CCT8高表达患者预后较差（P＜0.05），提示NSCLC患者中CCT8的表达水平与预后相关（图3）。

3 讨论

图2 免疫组化方法检测CCT8、Ki⁃67蛋白在NSCLC组织中的表达（×200）Fig.2 Expression of CCT8 and Ki⁃67 in NSCLC by immunohistochemistry（× 200）

表1 CCT8蛋白表达与NSCLC患者临床病理学特征的关系Tab.1 The relationship between CCT8 expression and the clinicopathologic factors 例

表2 临床特征与NSCLC预后的关系Tab.2 The relationship between the clinical parameters and the prognosis in NSCLC

图3 CCT8表达的生存曲线Fig.3 Correlation between patients′survival and the expression of CCT8

肺癌是全球发病率最高的肿瘤，严重威胁人类健康。由于起病隐匿，大部分肺癌患者确诊时已到晚期，5年生存率低［7］。众多通路参与NSCLC的发生发展，如 TGF⁃β/Smad4信号通路，Wnt/β⁃catenin信号通路［8］，表皮生长因子受体（EGFR）信号通路等［9］。细胞周期的失调可以导致肿瘤发生。癌基因的过表达与抑癌基因的缺失可导致肿瘤形成。许多癌基因参与肿瘤的形成，如EGFR，Ras基因［10］等。评估NSCLC预后的最重要指标包括原发肿瘤的大小，区域淋巴结受累，远处转移等。寻找病理组织学和生化标记物对于判断侵袭性NSCLC的不良预后及治疗反应起着尤为关键的作用。虽然随着治疗方法的不断进步，NSCLC患者的生存率和生活质量逐渐提高，但是寻找新颖的判断预后的指标具有重要的治疗意义［11］。

伴侣素（Hsp60）家族广泛存在于生物界，Arch分型将伴侣素（Hsp60）分为Ⅰ型和Ⅱ型两型，其中CCT属于Ⅱ型伴侣素，是目前真核细胞胞浆中发现的唯一伴侣素。CCT有8个不同的亚型，即CCTα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ。不同亚型的结构和成分还是有较大的异源性。CCT可以确保一些参与细胞生长和生存的蛋白正确折叠，包括微管蛋白、肌动蛋白、POLO样激酶1（Plk I）和细胞周期素E等。据相关文献报道，随着CCT亚型转录，处于G1/S期的细胞明显向S期转化，从而推动细胞周期 的 进 展 。 CCT8（Chaperonin containing TCP1，subunit 8）是CCT家族中的一个分子亚型，越来越多的实验数据报道CCT8在肠癌、胶质瘤和原发性肝癌中异常表达。

鉴于CCT8在细胞增殖中的重要性，研究其在NSCLC中的发生发展具有非常重要的意义。本文通过免疫组化发现CCT8在人NSCLC中高表达，并主要定位于细胞浆（图2），其趋势与细胞周期中重要的调节因子Ki⁃67一致。本研究结果显示NSCLC中CCT8的表达与患者组织学分级、临床分期、淋巴结转移状态、Ki⁃67表达水平有关（表1），进行K⁃M曲线（图3）分析提示：NSCLC患者中CCT8的低表达水平者的中位生存期为41个月，较CCT8高表达的NSCLC患者的中位生存期（27个月）延长了14个月，提示CCT8高表达的NSCLC患者预后较差。通过Cox回归分析表明，CCT8、淋巴结和Ki⁃67均可作为NSCLC预后的判断指标（表2）。本次研究存在以下不足：样本量不够大，无法分别分析CCT8在鳞癌和腺癌中的预后判断价值，随访时间不够长。以后的研究中，笔者将进一步分析CCT8在NSCLC中的分子功能及具体机制。

本研究结果表明CCT8在NSCLC组织中高表达，并与NSCLC的不良预后密切相关；CCT8可能促进NSCLC的发生发展。这为NSCLC的预后判断提供了新的依据，但其具体机制尚需进一步研究。

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