EGCG和顺铂合用抑制人肺腺癌NCI⁃H1975细胞和人肺鳞状上皮癌NCI⁃H520细胞增殖及对EGFR表达的影响

黄洁 李承红 陈实 钟金男 刘敏 李发久

江汉大学附属医院（武汉市第六医院）呼吸内科（武汉 430016）

现代实验研究证实“国饮”绿茶具有抗衰老、抗氧化、降脂和抑制肿瘤细胞增殖及肿瘤细胞迁移的作用［1-3］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epi⁃gallocatechin gallate，EGCG）是其药理学作用的主要活性成分［4］。最新研究［5-7］发现，EGCG 具有抗氧化、抗病毒和促进肿瘤细胞凋亡的作用。近年发现，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号通路参与人类肿瘤的发生发展的调节，该信号通路对细胞的生长、迁移、增殖和分化［8］。顺铂（Cisplatin）作为一种化疗药物，广泛的应用于包括肺癌在内的多种实体瘤的治疗［9］，研究［10-11］证实，在众多包括肺癌在内的众多实体瘤中存在高表达EGFR，且与顺铂对肿瘤的敏感性联系甚密，其可能是顺铂用于治疗晚期非小细胞肺癌等癌症的重要作用机制之一。然而，其并未取得满意的安全性和有效性。有研究［12-13］显示，EGCG在动物模型中显示出无毒性作用、抗突变和抗肿瘤的特性。EGCG可作为肿瘤耐药性的逆转剂，能够改善癌细胞对化疗的敏感性并减轻毒性作用，所以更多的临床研究更青睐于将EGCG与化疗、放疗等其他医疗手段并用来治疗癌症，具有广泛的抗非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，NSCLC）治疗前景［14］。目前已经有许多关于以顺铂为基础的联合化疗方案的系统评价，但尚未有EGCG与顺铂联合方案应用于NSCLC的体外实验研究和具体作用机制的研究的报道。本研究拟在NSCLC体外癌细胞上探究EGCG和顺铂联合使用对NSCLC细胞的增殖和凋亡的分子机制，为EGCG用于临床NSCLC治疗和耐药性改善提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂EGCG（规格10 mg，纯度≥97%，货号93894，Sigma），顺铂（规格 25 mg，纯度≥ 97%，货号P4394，Sigma）、人肺腺癌NCI⁃H1975细胞和人肺鳞状上皮癌NCI⁃H520细胞系由武汉大学生命科学院细胞库提供。Cell Counting Kit⁃8（CCK⁃8）试剂盒（碧云天生物有限公司），抗磷酸化EGFR（phospho⁃EGFR）和 EGFR 多克隆抗体（Protein⁃tech）。EGFR、β⁃actin引物由武汉擎科生物技术有限公司合成。

1.2 主要仪器电泳仪（美国Bio⁃Rad）；RT⁃qPCR反应仪（美国Bio⁃Rad）；荧光倒置显微镜（日本Olymics）。

1.3 细胞及其培养NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞株在37 ℃、5%CO2条件下，于10%FBS的RPMI⁃1640培养基中培养和传代。

1.4 EGCG和顺铂不同时间及浓度对细胞生长的影响取对数生长期的细胞，按照每孔2×103个/孔接种96孔板中，培养6 h贴壁。依次更换含0，20，40，80，160和320 μmol/L的EGCG，0，0.25，0.5，1，2，4和8 μg/mL的顺铂的培养基培养24，48和72 h。每孔加入 CCK⁃8溶液 10 μL，培养4 h后于450 nm处测定吸光度（OD）。抑制率=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组×100%。

1.5 EGCG和顺铂合用对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞凋亡的影响按照细胞数每孔1×105个/孔接种6孔培养板中，培养6 h后，更换为3 mL含2%FBS的培养基培养6 h进行细胞同步化；设置空白组、EGCG、顺铂和EGCG+顺铂组；依照Hoechst 33258染色操作，观察细胞核变化。

1.6 EGCG对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞中Pt和Pt⁃DNA结合物含量的影响采用Tris平衡酚法抽提DNA，并调节DNA浓度至100 ng/L后用5%硝酸处理后，用电感耦合等离子体质谱检测。

1.7 EGCG和顺铂合用对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞Phospho⁃EGFR和EGFR表达的影响提取细胞总蛋白并BCA法检测蛋白浓度。干热变性后，40 μg总蛋白用于Western blot。根据Image J2X计算的各条带灰度的变化，检测EGCG和顺铂合用对细胞Phospho⁃EGFR和EGFR蛋白表达影响。

1.8 EGCG和顺铂合用对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞EGFR mRNA表达的影响Trizol提取细胞总RNA，RT⁃PCR逆转录后取25 ng cDNA作为反应模版，20 μL PCR反应体系，反应程序：95℃预变性15 min，95℃变性10 s，60℃退火延伸30 s，扩增40个循环，扩增结束后制作融解曲线，以β⁃actin为内参，采用 2⁃△△Ct法计算 EGFR mRNA 的相对表达量。产物用含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。EGFR（177 bp）引物序列为 5′⁃AGGCAC⁃GAGT⁃AACAAGCTCAC⁃3′和 5′⁃ATGAGGACATA⁃ACCAGCCACC⁃3′。β⁃actin（250 bp）引物序列为5′⁃CATGT⁃ACGTTGCTATCCAGGC⁃3′和 5′⁃CTCCTTA⁃ATGTCA⁃CGCACGAT⁃3′。

1.9 统计学方法使用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析，实验结果以表示，两个样本均数用t检验，多个样本间采用完全随机的单因素方差分析，检验水平α为0.05，以P＜0.05作为具有显著差异的检验标准

2 结果

2.1 不同浓度和作用时间EGCG及顺铂对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞增殖的影响如图1所示，EGCG与顺铂的抑制作用随时间和浓度增加而增强（P＜0.05）。24 h抑制作用最好，分别为：EGCG的浓度为20 μmol/L，顺铂的浓度为4 μg/mL。

图1 不同浓度及作用时间EGCG和顺铂对NCI⁃H520、NCI⁃H1975细胞增殖的抑制作用Fig.1 EGCG and Cisplatin inhibit the proliferation of NCI⁃H520和NCI⁃H1975 cells at different concentrations and times

2.2 EGCG增强顺铂对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞的抑制作用如图2所示，EGCG与不同浓度的顺铂合用24 h后，相比于顺铂单独作用，抑制率显著增高（P＜0.05），且随顺铂浓度增加而增强（P＜0.05）。

图2 EGCG增强顺铂对NCI⁃H520 和 NCI⁃H1975 细胞的抑制作用Fig.2 EGCG enhanced inhibitory effect of Cisplatin on the proliferation of NCI⁃H520 and NCI⁃H1975 cells

2.3 EGCG 对NCI⁃H520 和NCI⁃H1975 细胞内铂和DNA⁃铂加合物含量的影响EGCG与顺铂合用作用细胞24 h，相比于顺铂单独作用，细胞内铂和DNA⁃铂加合物含量明显增加（P＜ 0.05），见图3。

2.4 EGCG和顺铂合用对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞凋亡的影响联合EGCG与顺铂时，两种细胞的细胞核固缩明显，数量较多，细胞凋亡增加。见图4。

图3 EGCG和顺铂合用提高细胞内顺铂及DNA⁃顺铂加合物含量Fig.3 The combination of EGCG and Cisplatin increases Pt and DNA⁃Pt adducts accumulation in the cells

图4 EGCG和顺铂合用促进细胞凋亡Fig.4 The combination of EGCG and Cisplatin promotes the cell apoptosis

2.5 EGCG和顺铂合用对NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞EGFR的影响联合使用EGCG与顺铂明显降低细胞内EGFR mRNA和磷酸化EGFR的表达（P＜0.05）。见图5。

3 讨论

EGFR及其下游分子下调可抑制肿瘤细胞的增殖，促进其凋亡［15-17］。顺铂作为临床重要的NSCLC治疗药物之一，其敏感性受到EGFR信号调节［18］。研究证实，顺铂治疗效果与EGFR突变密切相关［19］。因此，联合EGCG与顺铂可能在NSCLC治疗方面前景广阔。

图5 EGCG和顺铂合用明显降低细胞内EGFR mRNA和磷酸化EGFR的表达Fig.5 The combination of EGCG and Cisplatin reduces EGFR mRNA and phospho⁃EGFR expression in the cells

本研究证实，EGCG能有效抑制人NSCLC细胞株 NCI⁃H520 和 NCI⁃H1975 体外增殖和诱导凋亡，并且与顺铂合用作用增强。为鉴定EGCG的特异性，首先检测细胞中顺铂及DNA⁃顺铂加合物含量。发现EGCG明显诱导细胞内Pt⁃DNA复合体的堆积。提示EGCG可改善人NSCLC细胞株对顺铂的敏感性降低。考虑加合物通过阻断DNA复制而抑制细胞增殖［19］，同时，文献［6］报道EGCG影响多种癌细胞的凋亡。因此，我们进一步检测其对细胞凋亡的影响。结果发现，EGCG增强癌细胞的核固缩。证实EGCG可能通过改变DNA促进细胞凋亡。而EGFR是已知的NSCLC中高突变和高表达的分子受体，也与细胞增殖凋亡相关［8］。因此本研究亦检测了其蛋白和mRNA含量。结果显示，EGCG和顺铂合用明显抑制NSCLC癌细胞EGFR的磷酸化和mRNA表达。

综上所述，EGCG联合顺铂的抗NSCLC作用机制可能通过下调EGFR转录和EGFR磷酸化，抑制DNA合成依赖性的增殖和促进凋亡。本课题组曾选取人NSCLC细胞株NCI⁃H520和NCI⁃H1975细胞作为研究对象，首次发现EGCG具有相当的体外抑制NSCLC效果。同时又可增强顺铂的杀伤作用和降低其毒性。然而，EGCG是如何上调EGFR的转录活性和提高EGFR蛋白磷酸化水平，有待进一步证实，且是否有在体药理学效应和相似机制，以及对EGFR突变NSCLC的作用，仍有待研究。而本研究为将其联合顺铂开发成为一种高效低毒的抗肿瘤药提供了一定的依据，具有广泛的临床应用前景。

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