川楝素对顺铂抗肺癌活性的影响及其机制研究

叶海南

非小细胞肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤[1]。在肺癌的治疗中，以顺铂为代表的化疗是一线化疗方案。然而顺铂的长期大剂量使用会造成患者较大的副反应，且肺癌细胞对顺铂的敏感性会随着顺铂的长期应用而下降[2-3]。因此通过辅助治疗药物提高肺癌细胞对顺铂的敏感性是提高其疗效的有效方法。本研究的目的在于研究天然药物活性成分川楝素对顺铂抗肺癌活性的协同效应并研究其机制。

1 材料与方法

1.1材 料 川楝素（批号58812-37-6）购于南京春秋生物工程有限公司。顺铂（批号P4394）、噻唑蓝（MTT，批号 M2128）和凋亡检测试剂盒（批号APOAF）购于美国Sigma-Aldrich。DMEM培养基（批号11995065）购于美国Gibco。X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）、半胱天冬酶-9（Caspase-9）、半胱天冬酶-3（Caspase-3）和 β-肌动蛋白（β-actin）抗体（批号#14334、#9502、#9662、#4970）购于美国 Cell Signaling。蛋白G免疫共沉淀琼脂糖珠（批号SC-2002）购于美国Santa Cruz。增强化学发光（ECL）试剂盒（批号 32196）购于美国 Pierce。脂质体 2000（Lipofectamine 2000）（批号 11668019）和 pcDNA3.1（批号V79520）购于美国 Invitrogen。

1.2细胞培养 人非小细胞肺癌细胞系A549购于美国ATCC（美国模式菌种收集中心）。细胞培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养环境为37°C恒温培养箱中培养并通入5%CO2。细胞每2～3天传代一次，传代时，用胰酶消化液使细胞进入悬浮状态并用DMEM培养基洗涤两次，将细胞悬液按1:3稀释后传代。

1.3XIAP重组质粒构建和转染 将XIAP基因的开放阅读框架序列经PCR扩增后以分子克隆的方法与pcDNA3.1连接后构建成XIAP重组过表达质粒。A549细胞接种在6孔板中孵育过夜使之贴壁。将空质粒或XIAP质粒（终浓度为2μg/mL）用Lipofectamine2000进行包裹后将其加入到无血清培养基进行混合。将贴壁的A549细胞置于该无血清培养基孵育6h，之后弃去无血清培养基加入新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养24h。收集细胞用于后续实验。

1.4细胞活力抑制率测定 将A549细胞按5×103/孔接种在96孔板中，分为对照组、川楝素组、顺铂组、川楝素+顺铂组及川楝素+顺铂+XIAP质粒组。对照组为转染空质粒的A549不加药物处理48h，川楝素组为转染空质粒的A549加入10μmol/L川楝素处理48h，顺铂组为转染空质粒的A549加入2μmol/L顺铂处理48h，川楝素+顺铂组为转染空质粒的A549加入2μmol/L顺铂和10μmol/L川楝素处理48h，川楝素+顺铂+XIAP质粒组为转染XIAP质粒的A549加入2μmol/L顺铂和10μmol/L川楝素处理48h。药物处理完毕后加入 20μL MTT（5mg/mL）37°C 恒温培养箱中培养4h，移除孔内培养基，加入100μL二甲亚砜，570nm波长下测定OD值。细胞活力抑制率计算公式：细胞活力抑制率=（OD对照组-OD药物处理组）/OD对照组×100%。

1.5免疫共沉淀 将A549细胞按上述分组处理后进行细胞计数，取2×106个的各组细胞用蛋白提取液提取其中的总蛋白质。总蛋白质分成等量两份，一份在蛋白提取液中加入XIAP抗体孵育过夜，之后加入蛋白G琼脂糖珠孵育2h。孵育完成后离心收集管底的琼脂糖珠。琼脂糖珠加入Western blot上样缓冲液，沸水浴煮5min使蛋白质与糖珠分离，用于进行Western blot实验。另一份用作免疫共沉淀实验的对照（Input）直接进行Sestern blot实验，检测Caspase-9和Caspase-3的总量。

1.6Western blot实验 将A549细胞按上述分组处理后进行细胞计数，取2×106个的各组细胞用蛋白提取液提取其中的总蛋白质。将上述总蛋白质用12%SDS-PAGE进行电泳分离。分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到PVDF膜上，用XIAP、Caspase-9、Caspase-3 和 β-actin 抗体孵育过夜，之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白条带用ECL试剂盒显色发光。

1.7细胞凋亡实验 将A549细胞按上述分组处理后按照凋亡试剂盒说明书步骤将碘化丙啶（PI）和Annexin-V加入细胞中孵育20min，采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡，Annexin-V阳性细胞为凋亡细胞。

1.8统计学方法 所有实验重复3次，实验数据用（x±s） 表示并用SPSS14.0统计分析软件进行处理，两组间均数比较采用Student’s t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。

2 结果

2.1川楝素显著增强A549细胞对顺铂的敏感性MTT实验结果显示川楝素+顺铂组A549的细胞活力抑制率显著高于顺铂单处理组和川楝素单处理组（P＜0.05）。流式细胞实验结果显示川楝素+顺铂组A549的细胞凋亡率显著高于顺铂单处理组和川楝素单处理组，见表1。这些实验结果表明川楝素显著增强A549细胞对顺铂的敏感性。

2.2川楝素通过下调XIAP的表达抑制A549细胞中XIAP与Caspase-9和Caspase-3的相互作用 Western blot实验结果显示，川楝素处理能显著降低A549细胞中XIAP的表达水平（图1）。免疫共沉淀实验结果显示各组A549细胞中Caspase-9和Caspase-3的总蛋白量（Input）无差别，但川楝素处理能显著抑制XIAP与Caspase-9和Caspase-3的结合（图2）。这些结果表明川楝素能通过下调XIAP的表达抑制A549细胞中XIAP与Caspase-9和Caspase-3的相互作用。

表1 川楝素对顺铂抗肺癌活性的干预作用（%，x±s）

图1 川楝素对XIAP表达的干预作用

图2 川楝素抑制XIAP与Caspase-9和Caspase-3的相互作用

2.3川楝素通过抑制A549细胞中XIAP的表达增强顺铂的凋亡诱导活性 Western blot实验结果显示川楝素能显著增强顺铂对A549细胞Caspase-9和Caspase-3的活化，但转染XIAP质粒能显著抑制两者联合对A549细胞Caspases的活化（图3）。这表明川楝素通过抑制A549细胞中XIAP的表达增强顺铂的凋亡诱导活性。

3 讨论

川楝素是中药川楝子的主要活性成分，具有很强的药理学活性。近年研究发现川楝素还具有一定的抗肿瘤作用，对多种恶性肿瘤均有良好的辅助治疗作用[4-6]。本研究显示，川楝素能显著增强顺铂对肺癌细胞的杀伤活性和凋亡诱导活性，表明川楝素与顺铂存在协同效应，能提高顺铂的抗肺癌活性。

XIAP属于抗凋亡蛋白家族成员，它能与Caspases结合，从而阻止Caspases的活化，抑制凋亡的发生[7]。研究表明，肿瘤细胞中XIAP的过度表达能引起肿瘤细胞对化疗药物的抵抗，从而影响癌症患者的预后。因此XIAP目前已成为肿瘤治疗的一个靶点[8-10]。本研究发现，川楝素能显著下调肺癌细胞中XIAP的蛋白表达，进而抑制XIAP与Caspase-9和Caspase-3的相互作用。因此将肺癌细胞用川楝素处理后，细胞中游离Caspase-9和Caspase-3的水平显著增加，更多的Caspase-9和Caspase-3能在凋亡信号的作用下发生活化，最终导致肺癌细胞发生凋亡。当用XIAP表达质粒上调肺癌细胞中XIAP的表达后，川楝素对顺铂的协同效应受到明显抑制，证明川楝素是通过下调肺癌细胞中XIAP的蛋白表达增强顺铂介导的Caspase-9和Caspase-3的活化，导致细胞发生凋亡性死亡。

综上所述，川楝素能显著提高肺癌细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂的抗肿瘤活性。这些研究为提高顺铂的疗效降低其使用剂量提供了新的策略和思路。

图3 川楝素对A549细胞Caspase-9和Caspase-3活化的干预作用

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