虎杖对COPD模型大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1表达的干预研究

石亚莉 楼黎明 陈素珍 王世强 胡丹丹 黄冉冉 徐一凯

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo- nary disease，COPD）是一种以气流受限和呼吸系统症状持续存在为特征的常见疾病[1]。但目前为止COPD发病机制仍未完全明确，较肯定的包括蛋白酶/抗蛋白酶和氧化/抗氧化失衡、气道和肺实质慢性炎症等[2]，其中基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）、基质金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1）及其比值的研究较为广泛。已有实验研究证明虎杖提取物白藜芦醇对COPD模型大鼠肺组织发挥抗炎、抗氧化作用，对肺组织具有保护作用[3]。本研究采用熏烟和气管内滴入脂多糖（LPS）的方法创建大鼠COPD模型，以观察虎杖对COPD大鼠模型肺组织MMP-9和TIMP-1表达的影响，进一步探索其可能作用机制。

1 实验材料

1.1动 物 健康雄性SD大鼠40只，清洁级，体质量240～257g，周龄4周左右，来源于上海西普尔必凯实验动物有限公司，许可证号：SCXK（沪）2013-0016,由浙江中医药大学动物实验中心饲养（温度23～25℃，湿度约 70%）。

1.2药物与试剂 虎杖煎剂：杭州华东中药饮片有限公司生产，批号161020，由浙江省中山医院中药房煎至成1mg/mL备用。强的松：规格5mg/片，浙江仙琚制药股份有限公司生产，批号160693。脂多糖：规格 10mg/支，美国 Sigma公司，批号 L-2880。RNAiso Plus试剂盒（日本 Takara公司，批号 9109）；Prime－Script RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）反转录试剂盒（日本Takara公司，批号RR047A）；SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（日本 Takara公司，批号 RR820A）。

2 实验方法

2.1分组及模型制备 雄性SD大鼠40只随机分成正常对照组、COPD模型组、强的松组、虎杖组，每组10只。除正常对照组外，COPD模型组、强的松组、虎杖组采用烟熏+气管内注入脂多糖方法建立大鼠COPD模型[4]。将大鼠放入定制的有机玻璃烟熏箱内被动吸烟，1次20支香烟，持续1h，1天2次，每次熏烟间隔4h，熏烟8周。在烟熏的第1、14、28天用10%水合氯醛（10mL/kg）麻醉大鼠，经气管滴入LPS的生理盐水溶液（200μL）。

2.2给药方法 正常对照组、COPD模型组予6mL/kg生理盐水灌胃，强的松组予强的松6mg/kg灌胃，虎杖组予虎杖煎剂6g/kg灌胃，在熏烟的第29天开始药物干预，每天熏烟前30min给予大鼠灌胃，给药28天。

2.3标本采集 在给药第28天，大鼠予水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉采血处死。取左肺组织固定于福尔马林中备用；右肺组织经液氮速冻后，于-80摄氏度冰箱保存，待用RT-PCR检测。

2.4肺组织病理改变 左肺组织用梯度酒精脱水、浸蜡和包埋，制成石蜡块，用苏木素染色，盐酸酒精分化及自来水返蓝，之后伊红染色，再次脱水、透明、封片，于显微镜下观察炎症细胞浸润，光学显微镜下进行肺组织病理观察。

2.5Real-Time PCR法检测肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA表达水平 从液氮速冻右肺组织中提取细胞，按照RNAiso Plus Total RNA Reagent试剂盒步骤进行RNA的提取、洗涤、溶解，RNA浓度测定，再按照PrimeScript RT regent Kit With gDNA Eraser反转录试剂盒步骤进行cDNA的合成。最后将样品cDNA 稀释 5～20倍，选取内参基因（GAPDH）。采用SYBR试剂法，对所得的样品进行表达分析。放入LightCycler 480 Real-time PCR仪中进行扩增。荧光定量 PCR 反应程序：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40个循环；95℃，5s，60℃，1min，用于检测溶解曲线。采用2-△△CT法分析样品间的相对表达量。使用Primer5.0软件，分别设计目标基因和内参基因的QPCR引物（表1），引物由杭州华安生物技术有限公司合成。

2.6统计学方法 所有数据应用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料用均数±标准差（x±s） 表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1各组大鼠肺组织超微结构变化 对照组大鼠肺组织气道结构基本正常，上皮细胞完整，气道周围和血管周围组织未见炎症细胞浸润；肺泡形态正常，肺泡间隔未增厚；与正常对照组相比，COPD三组大鼠，肺组织大量上皮细胞脱落，黏膜上皮增生，炎性细胞浸润，肺泡间隔增厚，肺泡缩小，甚至出现肺泡实变。强的松组、虎杖干预组肺组织损伤轻于COPD模型组，见图 1（封底）。

表1 目标基因引物序列及产物长度

3.2各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA表达比较 与正常对照组比较，其余三组大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1 mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05）；与COPD模型组比较，强的松组、虎杖组大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1 mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05），见表 2。

表2 各组大鼠肺组织MMP-9、TIMP-1 mRNA相对表达量比较（x±s）

4 讨论

慢阻肺病理改变表现为气道、肺实质和肺血管的慢性炎症，炎症反应导致实质破坏、黏液高分泌，增加细支气管周围和间质纤维化，促进小气道气流受限的发生，而持续气流受限的重要因素之一为气道重塑[5]。诱发气道重塑的原因之一是细胞外基质（ECM）的异常降解和沉积，在ECM降解过程中，蛋白酶主要通过降解基质中的弹性蛋白，破坏弹性蛋白保持小气道通畅和肺泡壁弹性的作用，引起气道及实质的破坏，这种破坏是COPD肺气肿特征的重要成因[6]。此后新合成的弹性蛋白，不能完全形成链即ECM，发挥结构支撑的作用，这也可能是气道重塑的机理之一。

基质金属蛋白酶（MMPs）家族在已知的二十多个成员中MMP-9是最主要的弹性蛋白水解酶[7]。MMP-9主要来源于肺泡巨噬细胞、中性粒细胞，降解气道、肺泡基底膜及ECM中弹性蛋白，促进液体渗出、炎症介质释放，加剧黏液分泌和气道炎症反应[8]；弹性蛋白的降解，进而导致COPD肺泡基质及肺泡结构破坏，从而MMP-9参与气道重塑，导致持续性气流受限和炎症反应。TIMP-1是一种能特异性抑制MMP-9活性的金属蛋白酶组织抑制剂。TIMP-1通过抑制MMP-9的活性减少ECM的降解破坏，并能使肺泡ECM沉积，反映气道纤维化和修复重塑的过程[9]。MMP-9/TIMP-1的平衡是维持ECM正常状态所必须的，一旦平衡打破则出现病理状态。MMP-9、TIMP-1及其比值的平衡是维持基质正常状态所必须的。MMP-9、TIMP-1的表达及其比值升高，表明处于以炎症反应为主的病理状态，以组织破坏为主；表达及比值下降，气道表面以修复为主[10]。

慢阻肺归属中医“肺胀、喘证、咳嗽”，病位在肺、脾、肾三脏，病理因素主要为痰、瘀、虚三者。急性发作期的病机主要为痰热夹瘀，治则以祛痰化瘀，宣肺泄热为主[11]。虎杖始见于《雷公炮炙论》，其性味微寒微苦，归肝、胆、肺经，其主要功能有利湿退黄，散瘀止痛，清热解毒，止咳化痰等。活性成分主要有大黄素、大黄素甲醚、虎杖苷和白藜芦醇[12]。研究[12-13]证实白藜芦醇抑制香烟烟雾（CSM）介导COPD中肺泡巨噬细胞的炎症细胞因子释放，通过减少促炎细胞因子的释放，提高谷胱甘肽的含量，降低肺组织的髓过氧化物酶（MPO）活性，从而减少肺损伤。白藜芦醇亦可通过核转录因子（NF-κB）通路显著抑制基质金属蛋白酶的表达[14]，调节蛋白酶/抗蛋白酶平衡。慢阻肺急性加重期中医辨证分型，痰热瘀阻型约占47.3%[15]，组方多配伍虎杖归肺经以活血清热、化痰止咳[16]。

本实验发现，虎杖组、强的松组大鼠肺组织切片较COPD模型组结构较完整，此结果与虎杖及糖皮质激素对COPD肺组织具有保护作用的众多研究相符。与正常对照组比较，COPD三组大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1mRNA表达水平均明显升高（P＜0.05），这与 Higashimoto 等[17]的研究相符，提示MMP-9和TIMP-1参与慢阻肺气流受限及气道重塑的发生发展；经强的松、虎杖干预后，大鼠肺组织MMP-9和TIMP-1mRNA表达水平均明显降低（P＜0.05），证明二者均具有抗炎作用。提示虎杖用于COPD大鼠可显著改善MMP-9/TIMP-1失调，可抑制炎症反应、气道重塑，可保护肺组织、改善气流受限。但虎杖组干预作用不及强的松组（P＜0.05）。

综上所述，模型组COPD大鼠存在蛋白酶/抗蛋白酶的失衡状态，经虎杖煎剂干预后可改善肺组织MMP-9和TIMP-1mRNA表达水平及其失衡，有利于抑制其炎症反应，保护肺泡基质延缓气道重塑，但目前其机制尚未确定，有待进一步研究[本文受浙江中医药大学附属第三医院院级医药卫生科技计划（No.ZS16ZA01）、浙江中医药大学校级科研基金（No.2013ZR03）资助]。

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