HPLC法同时测定养心氏片中9个指标性成分

　　　　　　　

上海东方肝胆外科医院药材科，上海　200438

养心氏片是由十三味中药组成的复方制剂，处方包含黄芪、淫羊藿、黄连、炙甘草、党参、山楂、醋延胡索、丹参、地黄、灵芝、葛根、当归和人参。具有扶正固本、益气活血、行脉止痛的功效，常用于气虚血瘀型冠心病、心绞痛、心肌梗塞及合并高血脂、高血糖等症[1-2]。养心氏片所含的活性成分如黄酮类成分葛根素、大豆苷、芦丁、芹菜素均有明显的扩张冠状动脉，保护心肌缺氧性损伤的作用[3]；生物碱类成分延胡索乙素有镇静镇痛的作用[4]；酚酸类成分丹参素有活血化瘀的功效[5]。

目前养心氏片的研究多为临床应用方面的报道，与含量测定相关的研究多为其中单个成分的测定，如黄芪甲苷和葛根素的测定[6-9]，2015版《中国药典》含量测定项下仅有黄芪甲苷的HPLC测定。单个成分的测定作为养心氏片的质量控制不够全面。而由于组分复杂，同时测定其中的黄酮类、生物碱和酚酸类难度较大，目前亦未见相关报道。本研究采用高效液相色谱法同时测定了养心氏片中9个指标性成分，方法简便、准确，为养心氏片的质量控制及后期的作用机制研究提供基础。

1　仪器与材料

1.1仪器Agilent 1100高效液相色谱仪(含G1379A真空脱气机、G1311A四元泵、G1367A自动进样器、G1316A柱温箱、G1315B DAD检测器，美国安捷伦公司)；KUDOS- SK2200H超声发生器(上海科导超声仪器公司)；METTLER AE240型十万分之一电子天平(德国梅特勒公司)。

1.2材料葛根素(批号：110752-201615)、大豆苷(批号：111738-201603)、丹参素(批号：110855-201614)、芦丁(批号：100080-201610)、延胡索乙素(批号：110726-201618)、淫羊藿苷(批号：110737-201516)、芹菜素(批号：111901-201603)、人参皂苷Rd(批号：111818-201603)、阿魏酸(批号：110773-201614)购自中国食品药品检定研究院(纯度>98%)；养心氏片(批号：150406，上海医药集团青岛国风药业股份有限公司)；色谱级甲醇购自Burdick&Jackson公司，色谱级乙腈购自Merck公司，色谱级甲酸购自Fluka公司，水为纯化水，其余试剂为分析纯。

2　方法和结果

2.1溶液的配制

2.1.1对照品溶液如表1所示，精密称取如下样品于2 mL 量瓶中，加入2 mL甲醇定容，作为对照品储备液，存于4 ℃冰箱，待用。

2.1.2标准曲线的配制精密吸取上述对照品储备溶液各500 μL到10 mL 量瓶中，用甲醇定容，混匀，按照1∶2∶4∶8∶16∶32比例逐级稀释，制得标曲溶液。

2.1.3样品溶液的制备取2片养心氏片样品，剥除包衣放进研钵碾碎，精密称取1g置25mL量瓶中，加甲醇定容，超声30 min，补足失重，过0.22 μm微孔滤膜，制得样品溶液。

表1　对照品储备液的配制

2.2色谱条件色谱柱：Agilent Plus-C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流速：1.0 mL/min；流动相：A乙腈- B水(含0.1%甲酸)，A相随时间的变化：5%～40%(0～35 min)，40%(35～45 min)；检测波长：254 nm、310 nm；柱温：25 ℃；进样量：5 μL；分析时间：35 min；柱后平衡时间：10 min。混合对照品、养心氏片样品的HPLC色谱图如图1所示。

2.3线性关系考察养心氏片中各化合物的标准曲线、线性范围及相关系数见表2。

表2　养心氏片中各化合物的线性关系

2.4精密度试验取2.1.1项下制备的系列混合对照品溶液，在1 d内连续进样6次以及连续3d每天进样3次，根据所得峰面积分别考察日内和日间精密度。结果9个指标性成分的日内、日间精密度RSD均小于5%，表明该方法的精密度良好。

2.5定量限和检测线考察将9个对照品溶液依次进行稀释，以信噪比10∶1时，确定其最低定量限；以信噪比3:1时，确定其最低检测限。9个指标性成分的最低定量限分别为5.00、5.50、8.50、8.00、6.25、8.00、5.50、6.00、5.00μg/mL；最低检测限分别为2.50、2.75、4.25、4.00、3.13、4.00、2.25、3.00、2.50μg/mL。

2.6稳定性实验取制备的养心氏片样品溶液，分别在0、2、4、6、8、12、24 h测定9个成分的峰面积，考察其稳定性。结果9个成分峰面积的RSD分别为2.25%、1.23%、3.84%、4.26%、1.02%、2.52%、1.37%、1.28%、4.63%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7重复性试验精密称取同一批次养心氏片1g，共6份，按2.1.3项下方法，分别制成样品溶液进样分析。结果，养心氏片中9个成分含量的RSD均小于5%，表明该方法的重复性良好。

2.8加样回收率实验精密称取同一批次养心氏片0.5 g，共6份，分别加入对照品一定量 (样品中各成分含量的100%)，按2.1.3项下方法制备，进样分析，计算回收率。9个成分的加样回收率和RSD(n=6)分别为101.42%(RSD=1.48%)、102.74%(RSD=3.87%)、98.91%(RSD=1.67%)、199.35%(RSD=2.58%)、99.27%(RSD=3.27%)、98.59%(RSD=2.73%)、100.32%(RSD=3.42%)、102.53%(RSD=1.17%)、100.41%(RSD=3.63%)，回收率结果良好。

2.9样品测定养心氏片中各化合物的含量通过线性方程计算。见表3。

表3　养心氏片中各成分的含量

3　讨论

在色谱柱的选择上，考虑到待测成分较多，极性差别大，为了提高分离度，选用了250 mm长柱进行分析。由于同时测定组分较多，未能保证所有峰分离度均>1.5，其中葛根素和芦丁分离度>1.2，考虑到两者含量较高，为指标性成分，纳入了测定项，后期考虑用MS法准确定量。

在流动相的选择上，因各成分的参考流动相比例不同，采用了乙腈-水体系，梯度洗脱，从结果看，各成分可同时检测，分离度良好。在水相中加入甲酸可以防止葛根素、丹参素等成分出现拖尾峰，还可以抑制样品解离[10]。在检测波长的选择上，由于各成分的最大吸收波长各不相同，为了统一测定条件，并考虑到阿魏酸的特征吸收，同时选择了254 nm和310 nm两个波长，其中310 nm测定阿魏酸，254 nm测定其余8个成分。

由样品测定结果可见，养心氏片中多个活性成分含量稳定，其中治疗气虚血瘀的药如丹参、人参和葛根中所含的丹参素、人参皂苷Rd、葛根素的含量较高，符合本制剂的组方特点。本研究可同时测定养心氏片9个指标性成分的含量，方法简单，稳定可靠，可用于养心氏片的质量控制。

[1]严冬, 钱玉良，唐蜀华. 养心氏片治疗气虚血瘀型冠心病心律失常疗效观察[J]. 南京中医药大学学报, 2006, 22(5): 323-325.

[2]崔燕, 张辉，庄婕. 养心氏片治疗心绞痛及冠心病临床试验资料研究[J]. 食品与药品, 2013, 15(4): 293-295.

[3]高翠英, 仇同革. 养心氏片对冠心病治疗效果的观察[J]. 实用心脑肺血管病杂志, 2010, 18(12): 1801-1802.

[4]张鑫. 养心氏片长期治疗慢性稳定型心绞痛(气虚血瘀证)的临床研究[D].济南：山东中医药大学, 2014.

[5]张为. 养心氏片治疗冠心病慢性心力衰竭气虚血瘀证的临床研究[D].北京：北京中医药大学, 2007.

[6]张临通. 养心氏胶囊的质量标准研究[J].北京：中医研究, 2008, 21(9): 20-24.

[7]杨雪萍,袁红英,孙昕,等. HPLC法测定养心氏片中葛根素的含量[J]. 实用医药杂志, 2010, 27(9): 810-811.

[8]张春辉, 吴爱英，杨晓云. 薄层扫描法测定养心氏片中黄芪甲苷的含量[J]. 中国医院药学杂志, 2002, 22(2): 91-92.

[9]孙忠敏. HPLC-ELSD法测定养心氏片中黄芪甲苷的含量[J]. 海峡药学, 2005, 17(4): 75-76.

[10]王静, 徐艳红. 伪品养心氏片鉴别[J]. 时珍国医国药, 2000, 11(5): 418-419.