茄尼醇对大鼠实验性牙周炎的影响

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1.昆明医科大学研究生院，云南　昆明　650500；2.红云红河烟草(集团)有限责任公司，云南　昆明　650231; 3.昆明医科大学附属口腔医院，云南　昆明　650101; 4.云南中烟工业有限责任公司技术中心，云南　昆明　650231

牙周炎是一种牙周组织破坏的慢性炎症性疾病，而牙菌斑是牙周炎发生的始动因子，致病菌入侵时，中性粒细胞(Neutrophil)作为首要的防御细胞，吞入病原体清除这些有害物质的过程中, 激活细胞膜上的还原型辅酶Ⅱ(Nicotinamide adenosine denucleotide hydro-phosphoric acid, NADPH)氧化酶, 氧化酶摄取大量氧，还将还原型NADPH的一个电子传递给氧分子而形成超阴离子自由基((O2-)，导致自由基在体内逐渐增多，引起氧化应激，造成组织破坏[1-2]。

烟草(Nicotiana tabacum)为茄科(Solanaceae)烟属植物，废次烟叶中含有多种化学成分，其中许多都具有较高药用价值和营养价值，如烟碱、茄尼醇(Solanesol)、多酚类化合物等，且在废次烟叶中茄尼醇含量突出为0.5%～2.7%[3]。茄尼醇作为一种天然化合物，属于九聚异戊二烯伯醇或四倍半萜烯醇,分子式为 C45H14O，不溶于水。研究发现茄尼醇在烟草、马铃薯和桑叶中的含量较丰富，尤其是烟叶中茄尼醇含量最高，使得烟叶成为提取茄尼醇的主要原料[4-5]。当前，国际上以茄尼醇为原料的新药研制工作非常活跃，茄尼醇作为一种重要的医药中间体，很多药物连接上茄尼醇这样的长链烯基，往往能获得某些优良的性能[6]。文献报道，茄尼醇本身含有多个非共轭双键，以及它特殊的全反式链节结构使它具有非常强烈的吸收自由基的性能[7]和脂质抗氧化作用[8]。因此，其本身也有望成为有医疗效果的生化物质。

牙周炎的治疗，除了控制牙周致病菌，外源性补充抗氧化剂，可以通过调节免疫和氧化应激反应，提高体内抗氧化酶的活性，从而有效改善体内氧化还原平衡而缓解牙周组织的损伤[9]。因此，实验将以烟草中提取的茄尼醇为研究对象，通过应用牙周炎模型，初步探讨茄尼醇对牙周炎的影响作用，为其在牙周炎中的治疗或者改善牙周组织的状况提供实验参考数据。

1　材料和方法

1.1仪器YVITC001N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、Mettler Toledo高精密电子分析天平(Mettler Toledo公司)、DT5-1 离心机(时代北利)、BM-IX生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司)、石蜡切片机(上海市医疗器械工业公司医疗器械批发部修配厂)。

1.2试剂水合氯醛(Solarbio)；食用调和油(上海香满园，批号：20140829)；茄尼醇(纯度为97 %，云南云药医药研究有限公司)；SOD试剂盒(批号：20150708)、GSH-Px试剂盒(批号：20150708)、MDA试剂盒(批号20150708)等购置南京建成；TNF-α试剂盒(批号165232)、IL-1β试剂盒(批号154256)等购置深圳欣博盛；PGE2试剂盒(美国 RD公司)、TRAP试剂盒(Sigma，批号：SLBM2508V)。

1.3实验动物及分组选取四川省简阳市简城比尔动物养殖场提供的清洁级雄性SD大鼠126只，6周齡，体重180～220g(合格证号：SCXK(川)2013-24)。实验过程中遵循动物福利伦理原则。大鼠随机分为正常组(N组，18只)，牙周炎建模组108只。通过双侧上颌第二磨牙丝线结扎配合黏性高糖饮食4周建立牙周炎模型。成模后，牙周炎大鼠再随机分为牙周炎组(P组)、维生素C组(VitC组)、茄尼醇低剂量组(S1)、中剂量组(S2)、高剂量组(S3)，每组18只。

1.4牙周炎模型的建立及给药实验动物适应性喂养l周后，10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位固定四肢，用4/0 #医用丝线，在大鼠双侧上颌第二磨牙环牙颈部结扎，腭侧打结，并使丝线尽量位于龈沟内[10]。同法结扎对侧上颌第二磨牙，并从实验当天开始喂养l00g/L蔗糖和软食(常规鼠料用蔗糖水泡制)。建模成功后，每天早晨9点茄尼醇低、中、高剂量组分别按1.5 mg、3.0 mg、6.0 mg/100 g BW给药，维生素C组按10 mg/100 g BM给药[11]，茄尼醇通过食用调和油稀释，VitC通过生理盐水稀释。正常组和牙周炎模型组灌胃等体积的食用调和油，灌胃体积0.1 mL / 100 g。

1.5模型的评估4周后随机抽取建模大鼠4只，脱颈椎猝死，取其上颌骨，去净软组织，用电子数显卡尺测量上颌第二磨牙釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离[12]作为此牙的牙槽骨丧失值来评估模型是否成功。

1.6标本采集分别于灌胃后的2、4、6周末三个时间点每组随机抽取6只大鼠，在10 % 水合氯醛腹腔麻醉后腹主动脉采血。采血后，迅速分离上颌骨，一分为二，右侧上颌骨浸泡于4 %多聚甲醛固定液中，用于HE染色和抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)染色观察炎症变化和破骨细胞数量。左侧上颌骨置于75%酒精中，用于测量牙槽骨丧失程度(alveolar bone loss, ABL)。

1.7血液的检测收集的腹主动脉血3600 r/min，离心10 min，血浆-80 ℃保存，用于ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、白介素1β (inteleukins1-β, IL-1β)、前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2)蛋白表达水平，分别用羟胺法和DTNB法检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase, GSH-Px)的活性，TBA法检测丙二醛(malodiadehyde, MDA)含量。

1.9组织学检测

1.9.1HE染色取右侧上颌，4 % 多聚甲醛固定液4 ℃ 条件下固定24 h，15 % EDTA 脱钙液脱钙3～4周。系列乙醇脱水，二甲苯置换至石蜡包埋。近远中向连续5 μm厚石蜡切片，切片常规HE染色，在光镜下观察第一、二磨牙间和第二、三磨牙间的牙周组织病理变化。

1.9.2抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色) 按试剂盒说明进行Trap染色。破骨细胞鉴定标准为：胞核显多核、胞浆嗜酸性多伪足、胞体大而不规则，与牙槽骨表面直接接触或位于骨吸收陷窝内，行Trap染色后胞浆被染为红色，胞核为蓝色[13]，在400倍镜下，每张切片以牙槽嵴顶为起始，随机选取第二磨牙近远中侧牙槽嵴边缘的4个不重叠视野，分别计算每一个视野内的破骨细胞数，共计8个视野，并计算其均值，作为该片的破骨细胞数，每组4张切片，并进行统计。

1.10统计学分析应用SPSSl7．0软件包分析处理实验数据，采用单因素方差分析和LSD检验比较同一时间点6个组间的差异。所有组的数据使用K-S检验正态性，数据为正态性分布，使用单因素方差分析对6个组相应指标的均数进行显著性检验，并通过LSD检验进行样本均数的两两比较，以双侧P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1建模大鼠牙周情况随机抽取建模大鼠检测牙周组织情况，其牙颈部较多的软垢堆积，牙龈颜色鲜红、边缘圆钝，红肿剥离，牙龈轻触出血，HE染色可见大量炎症细胞浸润及紊乱的牙周胶原纤维束。去尽牙龈软组织可见牙槽嵴顶模糊呈虫蚀状，嵴顶呈凹陷状，第二磨牙釉牙骨质界至牙槽嵴顶的距离模型组(0.90±0.07)显著高于正常组(0.30±0.07)。如图1所示。

2.2给药后大鼠的一般特征和牙周情况

2.2.1一般特征由表1可知，灌胃期间，各组大鼠体重都在逐渐增加。灌胃2周末，正常组大鼠体重较重，与牙周炎组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，与茄尼醇各剂量组相比无明显差异(P>0.05)。灌胃4周末，正常组大鼠体重明显高于茄尼醇剂量组，差异有统计学意义(P<0.05)。灌胃6周末，各组大鼠体重两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。

组别剂量/mg/100g体重2周4周6周N组等体积溶媒30223±265740420±352142432±2390P组等体积溶媒26522±3212△33200±3214△41067±3124VitC组1029835±265436826±342943425±3613S1组1528836±353433800±3521△44214±2441S2组329721±3012435551±3864△42963±3864S3组628625±373833250±3751△43025±2484

注：与N组比较，△P<0.05。

2.2.2各组大鼠牙槽骨丧失情况由表2可知，灌胃2周、4周、6周后，与牙周炎组相比，茄尼醇各剂量组大鼠ABL有改善趋势，但是改善程度不明显，差异无统计学意义(P>0.05)，茄尼醇用药组的牙槽骨丧失明显多于正常组，差异均有统计学意义(P<0.05)，茄尼醇各剂量组间两两比较差异也无统计学意义(P>0.05)。

组别剂量/mg/100gABL2周4周6周N组等体积溶媒031±005032±002034±004P组等体积溶媒086±009△085±008△084±009△VitC组10085±006△080±009△077±005△S1组15085±007△082±008△080±005△S2组3086±007△082±008△080±009△S3组6085±010△081±009△079±008△

注：与N组比较，△P<0.05。

2.3组织学观察由图2～4可知，灌胃2周、4周和6周后，正常组：上皮附着位于釉牙骨质界处，无附着丧失(蓝色箭头所示)。牙周膜纤维排列整齐，牙槽嵴顶高度正常，无明显的炎症细胞浸润。牙周炎组：牙周袋内壁上皮显著增生，牙周组织大部分胶原纤维束紊乱甚至纤维束出现断裂，周围毛细血管扩张充血，冠1/3以上部位少量牙槽骨存在，结缔组织充满这些间隙内，袋底的结合上皮不规则的向根方退缩，牙槽骨高度明显降低。茄尼醇各剂量组及VitC组间差异不明显，均可发现牙周组织不同程度的破坏，牙槽骨高度降低，牙周袋和牙槽骨之间有粗大的胶原纤维束，结缔组织内浸润的炎症细胞，但牙周组织破坏较牙周炎组有改善趋势。

2.4抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色)光学显微镜下观察，多核破骨细胞内酶活性部位呈现红色沉淀，胞核染色蓝色(见图5)。对TRAP染色切片于400倍显微镜放大视野下观察计数，比较同一时间点不同组别之间破骨细胞数目变化情况，结果发现，牙周炎组大鼠破骨细胞数目明显多于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)。茄尼醇灌胃后破骨细胞数目与牙周炎组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。但随着灌胃时间的增加，各组的破骨细胞数目都有逐渐减少的趋势(表3)。

表3　各组大鼠不同时间点Trap染色破骨细胞数目变化情况 (个，

注：与N组相比，△P<0.01。

2.5血浆中炎症因子的表达

2.5.1茄尼醇对血浆中致炎因子IL-1β含量的影响作用由表4可知，灌胃2周、4周、6周后牙周炎组血浆中IL-1β的浓度高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。茄尼醇给药后三个剂量组IL-1β的浓度均低于牙周炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。随着灌胃时间增加，到灌胃6周后，茄尼醇高剂量组IL-1β的浓度与正常组及VitC组无明显差异(P>0.05)。

组别剂量/mg/100gIL-1β2周4周6周N组等体积溶媒1616±2551709±2451884±257P组等体积溶媒3583±347△3154±317△3255±355△VitC组102300±264△▲2165±244△▲2182±245▲S1组152388±219△▲2227±312△▲2368±332△▲S2组32496±267△▲2231±225△▲2413±327△▲S3组62616±234△▲2345±242△▲2234±316▲

注：与N组比较，△P<0.05；与P组比较，▲P<0.05。

2.5.2茄尼醇对血浆中致炎因子TNF-α含量的影响作用由表5可知，灌胃2周、4周、6周后三个时间点，牙周炎组TNF-α生成水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。茄尼醇灌胃后，TNF-α生成水平均显著低于牙周炎组(P<0.05)。灌胃4周和6周后，茄尼醇三个剂量组TNF-α的生成水平与VitC组相比差异无统计学意义(P>0.05)。且在6周时茄尼醇高剂量组TNF-α的生成水平与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

组别剂量/mg/100gTNF-α2周4周6周N组等体积溶媒2971±4552830±4452872±444P组等体积溶媒5838±512△5282±617△5051±410△VITC组104423±364△▲4155±489△▲4126±574△▲S1组153917±332△▲◆3896±312△▲4192±332△▲S2组34216±467△▲4083±225△▲3926±327△▲S3组64331±434△▲4119±342△▲3905±31△▲

注：与N组比较，△P<0.05；与P组比较，▲P<0.05；与VITC组比较，◆P<0.05。

2.5.3茄尼醇对血浆中致炎因子血PGE2含量的影响作用由表6可知，结果表明灌胃2周、4周、6周后，茄尼醇三个剂量组与牙周炎组相比，大鼠血浆中PGE2的生成水平均明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)，与VitC组相比差异无统计学意义(P>0.05)。随着灌胃时间增加，到6周末，茄尼醇三个组血浆中PGE2的浓度与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。

组别剂量/mg/100gPGE22周4周6周N组等体积溶媒145771±8327149100±17651161165±15330P组等体积溶媒210743±15883△207162±15183△232952±24492△VitC组10177423±9509△▲171391±7022△▲179013±6383▲S1组15173184±11084△▲165826±24082△▲168932±17759▲S2组3184632±12474△▲174002±18015△▲173632±15685▲S3组6183812±17790△▲168211±15679△▲166324±19479▲

注：与N组比较，△P<0.05；与P组比较，▲P<0.05。

2.6大鼠血浆中氧化应激指标的变化

2.6.1茄尼醇对血浆中MDA含量的影响作用由表7可知，灌胃2周、4周、6周后，牙周炎组MDA的生成水平显著高于正常组(P<0.05)。茄尼醇给药后三个剂量组MDA的生成水平都显著降低，与牙周炎组相比，差异均有统计学意义(P<0.05)，灌胃2周和4周后，茄尼醇低剂量组MDA的生成水平接近正常组，差异无统计学意义(P>0.05)。到灌胃6周后，茄尼醇三个组MDA的生成水平均与正常组接近，差异无统计学意义(P>0.05)。灌胃同一时间点末茄尼醇各剂量组两两比较，差异也无统计学意义(P>0.05)。

组别剂量/mg/100gMDA2周4周6周N组等体积溶媒506±052473±053503±065P组等体积溶媒714±063△688±022△756±066△VitC组10474±068▲447±059▲438±068△▲S1组15531±039▲◆503±052▲◆526±052▲◆S2组3567±067△▲◆517±045△▲◆513±077▲◆S3组6570±054△▲◆518±062△▲◆501±066▲◆

注：与N组比较，△P<0.05；与P组比较，▲P<0.05；与VITC组比较，◆P<0.05。

2.6.2茄尼醇对血浆SOD活性的影响作用由表8可知，灌胃2周、4周、6周后牙周炎组SOD活性均低于正常组，茄尼醇给药后三个剂量组SOD活性都明显高于牙周炎组，差异有统计学意义(P<0.05)，灌胃2周和4周后茄尼醇三个剂量组和正常组及VitC组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。到灌胃6周后，茄尼醇高剂量组与正常组、VitC组相比差异仍无统计学意义(P>0.05)。同一时间点末，茄尼醇三个剂量组两两相比差异无统计学意义(P>0.05)。

组别剂量/mg/100gSOD2周4周6周N组等体积溶媒24783±247224644±299024913±1303P组等体积溶媒17389±986△17490±2077△14913±2657△VitC组1023797±2509▲23853±3129▲25679±1569▲S1组1522418±2063▲23222±2306▲21019±2610△▲◆S2组321582±2699▲22121±2047▲22240±1903▲◆S3组621633±2532▲22734±1941▲24078±2049▲

注：与N组比较，△P<0.05；与P组比较，▲P<0.05；与VITC组比较，◆P<0.05。

2.6.3茄尼醇对血浆中GSH-Px活性的影响作用由表9可知，灌胃2周、4周、6周后，牙周炎组GSH-Px活性都低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。茄尼醇给药后，三个剂量组的GSH-Px活性都高于牙周炎组，差异有统计学意义(P<0.05)。到4周末，茄尼醇低剂量组GSH-Px活性与正常组接近，差异无统计学意义(P>0.05)。到6周末，茄尼醇高剂量组的GSH-Px活性继续升高与正常组相比，差异无统计学意义(P>0.05)。三个时间点末，茄尼醇三个剂量组两两相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表9　不同时间点各组大鼠血浆中GSH-Px的活性情况　(酶活力单位,

注：与N组比较，△P<0.05；与P组比较，▲P<0.05；与VitC组比较，◆P<0.05。

3　讨论

烟草化学成分多种多样，其中许多都是具有一定应用价值的生物活性物质，这些物活性成分主要有烟碱、茄尼醇、绿原酸、芦丁、功能蛋白、活性多糖等[14]。烟草中的萜类化合物茄尼醇、酚类化合物绿原酸以及黄酮类物质都有一定的抑菌、抗炎以及较好的清除自由基的能力，是具有潜力的抗氧化剂[15-17]。牙周炎症中，研究发现在自由基过量或抗氧化剂不足的条件下，增多的自由基可直接参与菌斑-宿主免疫反应，自由基在牙周组织损伤的致病机理中起着一定的作用[18]。从而也暗示我们调控炎性因子和自由基的生成对牙周病的发生和治疗起着重要作用。研究发现茄尼醇具有较强的抗生物活性[19]，但其在牙周炎的防治中是否起到作用，目前鲜见相关报道。因此，实验通过实验性牙周炎大鼠模型对烟草提取物茄尼醇的潜在疗效进行评估。

牙槽骨吸收总量可以客观地反映牙周破坏程度，衡量和判断牙周组织状况，是牙周病诊断中重要的检查指标。本实验中牙周炎组牙周组织破坏最严重，牙槽骨丧失较多。给药2周、4周、6周后，维生素C组以及茄尼醇各剂量组牙龈炎症减轻，探诊出血减少。HE染色可发现胶原纤维紊乱和断裂有所减轻，结合上皮及牙周膜内的炎症细胞数目减少，但炎症反应并没有恢复到正常水平。灌胃期间牙周炎组ABL也出现逐渐改善的情况，说明局部刺激因素去除后，大鼠牙周组织有一定的自我恢复能力，结果与张鲲的研究结果相符合[20]。但是，茄尼醇组ABL以及破骨细胞计数与牙周炎组相比差异没有统计学意义，其中年龄可能是一个影响因素，大鼠开始灌胃时已有11周龄，本实验中灌胃2、4、6周三个时间段，成年大鼠要观察到骨修复可能时间需要适当延长[21]。此外，由于本实验是关于茄尼醇对牙周炎作用的初步探讨，茄尼醇的用量以及用药时间需要进一步的研究。

TNF-α和IL-1β在牙周炎的发生发展中起着关键的作用，IL-1β和 TNF-α 能够募集炎症细胞，诱导PGE2和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPS)的产生，抑制胶原合成，刺激骨吸收、组织降解以及基质细胞的凋亡从而限制了牙周组织的修复[22]。本实验显示牙周炎组血浆中TNF-α、IL-1β浓度最高(P<0.05)，给药2、4、6周后，茄尼醇剂量组下调了血浆中炎症因子的表达，其抗炎效果与维生素C组相似，我们推测茄尼醇下调炎症因子可能是通过调控NF-κB而实现。研究显示在牙周组织中NF-κB的激活率达到了75 %～ 90 %，明显的高出了正常组织的5 %～ 30 %，NF-κB又能上调炎症因子的表达，表明了NF-κB的活化在牙周炎的发生发展中也起着重要因素[23]。

在牙周炎发展过程中，机体内菌斑-宿主免疫反应，使机体产生过度的活性氧(包括氧化自由基和非自由基活性物质)，长久后引起机体抗氧化酶水平下降。超氧化物歧化酶(SOD)作为机体重要的抗氧化酶，是机体内唯一能够清除生物氧化所产生的超氧阴离子的酶[24]。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是一种广泛存在于机体组织细胞线粒体、胞质内以及生物膜上的水溶性四聚蛋白酶，它不仅可以清除过氧化氢，同时还可以清除脂质过氧化物[25]。丙二醛(MDA)是自由基与多聚不饱和脂肪酸反应的终末产物，在机体内其含量的高低间接反映了细胞受到自由基攻击后的损伤程度[26]。实验期间，牙周炎组SOD和GSH-Px这两种酶的活性明显下降，MDA的含量升高。可能由于牙周炎症期间外周血中PMNs处于较敏感的反应状态，产生并释放大量的自由基[27]。茄尼醇灌胃2周、4周、6周后，SOD和GSH-Px的活性都出现增加，MDA含量降低，与牙周炎组相比，有显著性差异(P<0.05)。茄尼醇组的抗氧化作用效果和维生素C组相似，暗示茄尼醇潜在的抗氧化活性，但是茄尼醇的抗氧化机制尚不清楚。

综合体内动物实验数据发现茄尼醇有较好的抗炎和抗氧化的性能，但作用机制尚不清除。根据相关实验数据和结果推测可能有以下的原因：首先，大鼠通过结扎诱导牙周炎症模型，创伤和感染引起宿主的免疫应答反应，宿主细胞在清除病原体的过程由于“呼吸爆发”作用产生大量的自由基。茄尼醇其自身特殊的多共轭双键结构可以清除自由基[19]，改善大鼠的氧化应激状态，阻止机体细胞胞浆中对氧化还原敏感的核转录因子NF-κB入核[28]，下调炎性细胞因子的生成。其次，茄尼醇可能作用于机体内的抗氧化反应原件(antioxidant responsive element, ARE)诱导机体抗氧化酶系统产生抗氧化需要成分(SOD、CAT、GSH-Px)，从而增强大鼠抗氧化能力影响其牙周炎的进展。

总之，灌胃茄尼醇后减轻了结扎诱导的牙周炎大鼠全身氧化应激状态和炎性因子的表达，研究结果可为茄尼醇的临床应用及改善牙周状态提供实验参考数据。但是实验中茄尼醇促使牙周炎愈合的机理尚不明确，后续实验中需要深入探索明确其作用机理。

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