两步酶法在小鼠睾丸支持细胞分离与培养过程中的研究

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1．贵州医科大学，贵州　贵阳　550002；2．贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州　贵阳　550014

小鼠睾丸支持细胞是存在于小鼠睾丸生精上皮内的一种非生殖细胞，对生殖细胞具有支持营养作用[1]，每个支持细胞都营养着一定数目的生殖细胞[2-3]。研究发现其可通过旁分泌途径分泌多种生长调节因子，如胶质细胞神经营养因子GDNF、表皮生长因子EGF、转化因子等，维持精原细胞周围微环境为其提供营养支持并调控其增值及分化[4-6]。因此分离出高纯度的支持细胞对研究精原细胞的增值并分化成为精子的过程具有重要意义。研究精子在体内的发生机制及其影响因素，必须模拟其真实的体内环境，分离高纯度的支持细胞是其必要条件。以往国内实验分离过程较为繁琐，纯度不高，本实验在文献报道的基础上改良分离方法，就如何简便高效率的分离小鼠睾丸支持细胞并进行纯化和鉴定做出初步探讨，为今后进一步研究奠定基础。

1　仪器与材料

1.1动物出生7～8 d的雄性昆明小白鼠，由贵州医科大学动物实验中心提供。

1.2仪器二氧化碳培养箱(萨默飞世尔科技有限公司)；clean work station洁净操作台(萨默飞世尔科技有限公司)；BECKMAN-COULTER台式离心机；Nikon倒置显微镜；Axiocam-Mrc倒置荧光显微镜；电子天平(梅特勒托利仪器有限公司)；一抗波形蛋白(Proteintech公司)；二抗FITC标记的羊抗兔IgG(Proteintech公司)；胶原酶Ⅳ(北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司)；胎牛血清(北京索莱宝科技有限公司)；DMEM/F-12培养基(Sigma公司)；其他试剂均为国产分析纯。

2　方法

2.1原代小鼠睾丸支持细胞的分离取出生7～8d的雄性昆明小鼠15只，脱颈处死，泡置75%酒精5 min，消毒。于超净工作台内，分离小鼠双侧睾丸，放入盛有PBS的培养皿中，并于培养皿中钝性分离白膜。用吸管将睾丸转移至10 mL离心管中，用PBS吹打洗涤3遍，充分去除白膜及睾丸周围组织，去除上清。剪碎睾丸组织，加入10倍体积0.2%胶原酶Ⅳ，37 ℃水浴锅消化10 min。加入5～10mLPBS轻轻吹打1～2 min,600 r/min离心2min，弃上清，重复2次。加入10倍体积的0.25%胰蛋白酶(无EDTA)，于37 ℃水浴锅消化20 min，期间每3min摇晃吹打一次，使得睾丸组织充分接触胰酶。加入等量含10%胎牛血清DMEM/F-12培养基终止消化，200目细胞筛过滤悬液。滤液于1000 r/min离心6 min，弃上清，加入10倍体积含10%胎牛血清DMEM/F-12培养基充分吹洗，重复3次。细胞计数板计数，调整浓度5×105个/mL接种于的含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养基中，放置37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

2.2原代小鼠睾丸支持细胞的纯化原代细胞培养6 h后取出，轻轻摇晃培养皿，将未贴壁及贴壁不牢固的精原细胞游离，吸取丢弃培养液及游离的精原细胞。加入新的培养液。分别于12 h、18 h、24 h重复上述操作。培养至48h，0.25%胰蛋白酶(无EDTA)2 mL加入培养皿中，快速摇匀消化15 s，弃掉胰酶及消化下的剩余精原细胞。加入培养基摇晃清洗3遍后继续至于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。72h后重复上述步骤1次。

2.3小鼠支持细胞的鉴定

2.3.1形态学鉴定小鼠支持细胞培养6h开始贴壁，12h呈条梭型，24h胞体出现突触，48h细胞进一步铺展呈片状。而精原干细胞则呈现圆形随着培养连接呈圆形串珠样，以此可初步鉴别。

2.3.2小鼠睾丸支持细胞的免疫学鉴定取培养2周支持细胞做鉴定，PBS洗涤2遍，3 min/遍。加入4%多聚甲醛固定20 min后PBS洗涤3遍，3 min/遍。加入4 mL的0.1%Tween-20(PBST)于培养皿10 min透化细胞，PBS洗涤2遍，3 min/遍。加入含5%BSA的PBST(封闭液)封闭细胞45 min。用一抗封闭液按1∶200稀释一抗并加入培养皿，4 ℃冰箱过夜。二抗稀释液洗涤细胞3遍，5 min/遍。用二抗封闭液按1∶200稀释二抗并加入培养皿，37 ℃度培养箱放置90 min。PBS洗涤细胞3遍，加入DAP试剂覆盖细胞表面1 min，PBS洗涤3次。荧光显微镜观察。

3　结果

3.1倒置显微镜观察初步分离的细胞为精原细胞及支持细胞混合悬液，由于两种细胞均呈现游离状态，显微镜观察均呈现圆形，无法鉴别，培养6h左右开始贴壁生长，呈规则小圆形，精原细胞呈现游离状态，形状仍为规则圆形(图1)。培养12h后，支持细胞进一步贴壁，呈现梭型，部分残存精原干细胞呈圆形。培养24h后，可见支持细胞部分伸出突触，细胞间仍有空隙(图2)。培养72h，可见支持细胞平铺于培养皿底部，呈片状，伸出3～5个突触，细胞之间相互接触。可见细胞核位于胞体中部或稍偏位(图3)。

3.2DAPI染色DAPI是一种可以穿透细胞膜与细胞核中DNA结合的荧光染料。对支持细胞PI染色，在荧光显微镜下可见细胞核呈蓝色，散在分布，细胞核的位置及支持细胞的位置所在(图4)。

3.3免疫组化鉴定用支持细胞特异性抗体波形蛋白(一抗)标记支持细胞，用带有绿色荧光的FITC标记的羊抗兔IgG(二抗)特异性结合一抗，于荧光显微镜下观察到支持细胞呈现绿的片状，相互接触(图5)。细胞位置与对应的PI染色一致。可证明为存活的小鼠睾丸支持细胞。

4　讨论

小鼠睾丸组织内的支持细胞，是一种具有重要功能的间质细胞，为精子的发育提供必要的微环境[7]。研究表明支持细胞的数量影响着睾丸的大小及睾丸中所发育成熟的精子的数量及质量[8]。平均每个小鼠睾丸中能获得细胞在105～106个左右，其中支持细胞占大部分[9]。对支持细胞进行高纯度的分离及体外培养是进一步研究精子的发生发展的必要先决条件。1周左右小鼠睾丸生精小管组织中存在大量支持细胞且增殖活跃[10]。实验选用出生7～8d小鼠，既保证了所获取细胞的纯度，又避免了小鼠过小带来的取材不便等问题。目前分离与纯化小鼠睾丸支持细胞的方法没有一种较为统一的方法，以往报道的支持细胞分离纯化方法有一步酶分离法，Percoll密度梯度分离纯化法等，一步酶分离法实验过程较为简单，细胞存活率较高，但所得细胞纯度不高且组织杂质较多需要后续进一步去除。Percoll密度梯度分离法可将支持细胞及精原细胞充分分离，得到高纯度的两种细胞，但高速离心的时间就需20 min左右，长时间的高速离心会使得细胞受到离心力较大影响，使得分离所得细胞存活率较低，故所需的实验原料过多，且此种方法对实验仪器及实验操作过程要求较高，实验步骤较复杂不适宜初学者。此外还有免疫磁株分选法及免疫荧光分选法，此两种方法成本过高，操作繁琐，极大地限制了其应用。实验采用两步酶分离法，第一步先去除睾丸中的间质纤维等组织，第二步消化分离支持细胞。利用小鼠睾丸支持细胞贴壁速率不同，6 h时支持细胞基本已经完成贴壁，而精原细胞大多仍呈现游离状态，此时进行第一次换液，可以去除大部分精原细胞，为初步一次纯化。此后利用差速贴壁多次换液进一步纯化。因为多次震荡换液，在48h时已使得精原细胞只有极少一部分不牢固的贴壁残余，此时使用胰蛋白酶短时间快速消化并换液，使得这一部分残余精原细胞被进一步去除，而活力较好的支持细胞则因为贴壁较为牢固而无法被短时间胰酶消化分离。本实验多次验证获取的支持细胞纯度可达到90%左右。相比于其他方法，此方法操作过程较为简单，实验成本较低，较易学习，获取的支持细胞纯度较高，可满足后续实验要求，可为初学者首选方案。

目前支持细胞的鉴定方法主要是形态学鉴定，采用倒置显微镜观察及电镜观察；另一种鉴定方法是DNA免疫标记：观察到特征性双核仁结构[11-13]；还有免疫组化法鉴定。本实验选取形态学鉴定联合PI染色及免疫组化鉴定的方法，先从大体形态学层面进行初步鉴定，再选用特异性免疫标记物波形蛋白进行免疫鉴定[14]。结果充分证实了本实验方法可得到纯度较高、存活率较高的小鼠睾丸支持细胞，为今后进一步研究奠定实验基础，值得推广。

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