气相色谱内标法测定松节中α-蒎烯的含量

　　　　　　　　　

1.贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心/药用植物功效与利用国家重点实验室，贵州　贵阳　550004； 2.贵州医科大学药学院，贵州　贵阳　550025；3.贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心，贵州　贵阳　550004； 4.贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室，贵州　贵阳　550004

松节为松科植物云南松(PinusyunnanensisFranch.)、马尾松(PinusmassonianaLamb.)的干燥瘤状节，具有祛风燥湿，舒筋活络，活血止痛之功效，可用于关节疼痛，筋骨挛急，脚痹痿软，跌扑瘀诸病[1]。松节入药始载于《名医别录》[2]，广泛分布于四川、云南、贵州和广西等地。收载于《贵州省中药、民族药材质量标准》(2003版)，但该标准未明确规定其质量控制方法，对不同来源的松节药材中α-蒎烯含量进行含量测定，为松节药材的质量标准提升提供依据，有一定理论意义和实际应用价值。目前对于松树药用价值的研究，主要是针对松花粉、松针、松香和松节油，而对松节的研究较少[3]。α-蒎烯为松节中重要的组成成分之一，也是松节油中主要成分，可用于肌肉痛及关节痛，许多进口药用油均以α-蒎烯含量作为质量指标[4]。中药材一般成分复杂，质量难以把控，然而单一成分含量标准具有较好的可控性和易操作性，为现在最常用的方法之一。研究以α-蒎烯作为指标成分，使用环己酮作为内标，运用气相色谱法对其含量进行研究，为松节的质量控制提供依据。

1　仪器与材料

1.1仪器GC 2010plus型气相色谱仪(自动进样器，氢火焰离子化检测器，日本岛津仪器有限公司)；安捷伦7890A型气相色谱仪；KQ-300DE超声机(昆山市超声仪器有限公司)；XR 2O5SM-DR十万分之一电子天平(瑞士Precisa)。

1.2材料α-蒎烯对照品(批号：110897-200001，中检院)；11批松节样品(详见表6)由贵州医科大学药学院生药学与药用植物学教研室龙庆德副教授鉴定，正己酮(内标)、无水乙醇均为色谱纯。

2　方法与结果

2.1气相色谱条件色谱柱：ZB-5毛细管柱(5%苯基95%二甲基聚硅氧烷，30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)；流速为1.0 mL/min；程序升温：初始温度60 ℃，保持2 min，以20 ℃/min速率升温至160℃，再以120 ℃/min速率升温至260 ℃，保持2 min；进样口温度200 ℃；FID检测器温度300 ℃；进样量1 μL，10∶1分流比进样。上述色谱条件的图见图1。

2.2内标溶液的制备精密量取环己酮100.33 mg至5 mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，再精密吸取2.5 mL至500 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，作为内标溶液。

2.3对照品溶液的制备精密称取α-蒎烯对照品26.22 mg至100 mL容量瓶中，用内标液稀释至刻度，再精密吸取2 mL至5 mL容量瓶中，用内标液定容至刻度，作为对照品溶液。

2.4供试品溶液的制备取本品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入内标液25 mL，密塞，称定重量，超声处理(功率100 W，频率50 kHz，水温30 ℃)20 min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.5线性关系的考察精密称取α-蒎烯对照品26.81 mg至50 mL容量瓶中，用内标溶液稀释至刻度，再分别吸取4、2、1、0.5、0.25、0.125 mL至5 mL量瓶中，用内标溶液定容，分别吸取上述溶液1 μL进样，记录峰面积。以α-蒎烯的峰面积与内标峰面积的比为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程：y=15.759x-0.0946，R=0.9996，表明α-蒎烯在0.125～4 mg浓度范围内线性关系良好。

2.6重复性实验分别精密称取同一松节药材粉末1.5 g (3份)，2 g (3份)，2.5 g (3份)，共计9份，按供试品溶液制备方法及色谱条件，分别测定松节的含量，结果RSD为1.19%，表明仪器的重复性良好。

2.7中间精度实验变更操作人员，变更日期，在同一实验室，按上述方法分别制备3份供试品溶液，使用岛津GC 2010气相色谱仪连续进样6次，进样量1 μL。第一次测定α-蒎烯的含量平均值为1.176 mg/mL，RSD为0.73%；第二次测定结果的平均值为1.176 mg/mL，RSD为0.86%，说明方法的中间精密度良好。

2.8耐用性实验

2.8.1稳定性实验取同一供试品，按“2.4”方法制备供试品溶液，取供试品溶液一份，吸取1 μL根据GC分析时间，在0/1/2/4/6/8小时分别进样5次，记录α-蒎烯峰面积，RSD为0.54%，表明供试品中α-蒎烯再8小时内稳定。结果见表1。

表1　稳定性实验结果

2.8.2不同色谱柱比较按照拟定的色谱条件分别以HP-5 (30 m × 0.32 mm × 0.25 μm)和ZB-5 (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)两种石英毛细管柱对同一批号3份供试品溶液进行含量测定，结果两种不同品牌色谱柱测定结果基本一致。结果见表2。

表2　不同色谱柱测试结果

2.8.3不同进样口压力比较将进样口压力变为75.4、80.9和87.1 kPa，其余色谱条件不变，对同一批号3份供试品进行测定，结果表明改变进样口压力，含量测定结果基本一致。结果见表3。

表3　不同进样口压力测试结果

2.8.4不同仪器比较分别以安捷伦GC 7890A、岛津GC-2010Plus，其余条件不变，对样品进行测定，结果表明，两种品牌两种型号的气相色谱仪测定结果基本一致。结果见表4。

表4　不同仪器比较

2.9回收率试验取同一批含量为1.174 mg/g的松节药材粉末9份，每份2 g，分别按样品中α-蒎烯本底值加入50% (3份)、100% (3份)、150% (3份)的对照品，按“2.4”方法制备供试品溶液，按“2.3”方法制备对照品溶液，按照拟定的色谱条件测定。α-蒎烯平均回收率为103.81%，RSD为0.71%。结果见表5。

表5　加样回收率实验结果

2.10样品测定取松节样品11批，每份样品精密称取2份，每份2 g，按“2.4”方法制备供试品溶液，按“2.3”方法制备方法对照品溶液，按照拟定的色谱条件进行测定，计算α-蒎烯含量。结果见表6。

表6　不同来源松节α-蒎烯含量测定

续表

表6　不同来源松节α-蒎烯含量测定

3　讨论

松节作为常见的中药材，广泛应用于中药处方中，在《名医别录》和《本草汇言》等书中均有提及，但其质量标准尚未明确。2015年版《中华人民共和国药典》采用α-蒎烯作为油松节指标性成分[5]，鉴于油松节和松节药效作用相似，研究使用α-蒎烯作对不同产地的松节进行含量测定，对松节的质量控制，具有一定的实用意义。

内标法具有测定结果较为准确的优点，是气相色谱中常用的定量方法。本研究采用气相色谱内标法测定松节中α-蒎烯的含量。内标物的选择方面，在确定α-蒎烯的保留时间后，考察了不同化合物(环己醇、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、环己酮等)与指标成分的分离，最终选择可以与α-蒎烯保留时间相近且分离较好的环己酮作为内标物。本实验确定的色谱条件在不同仪器(日本岛津GC-2010plus，安捷伦7890A型)，不同色谱柱(HP-5、ZB-5)以及不同进样口压力下均显示出较好的耐用性。

综上，本研究使用经济低毒的无水乙醇超声提取松节简单方便，采用气相色谱内标法测定松节中α-蒎烯含量，具有快速、简便、准确的优点。不同批次的松节中α-蒎烯相差较大，可能是松树的生长环境、年限以及储藏条件等原因造成的。

[1]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材、民族药材质量标准[M].贵州:贵州科技出版社,2003:247.

[2]陈曦.HPLC测定松节、松针和松香中银松素和甲基醚的含量[J].天津药学，2014，26(5)：21-23.

[3]张林林，薛健，刘东静，等.油松节药材中α-蒎烯的测定方法研究[J].中草药，2009，11：1817-1818.

[4]朱沛韶，陈浩桉，吴翔.松节油中α-蒎烯的测定[J].中药材，1999，22(7)：362-363.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M] .北京:中国医药科技出版社, 2015:227.