西黄丸通过调控Bcl-2/Bax蛋白表达促进乳腺癌耐药细胞凋亡*

金 淦 孟旭莉,# 刘小珍 李永峰 姚庆华 郑庆辉 汤鸿超 钱佳诚 徐 超 芮鑫淼

1 浙江中医药大学第二临床医学院 浙江 杭州 310053

2 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

3 浙江省肿瘤医院 浙江 杭州 310022

4 浙江医院 浙江 杭州310013

本研究以多西他赛耐药的人乳腺癌细胞MDA-MB-231/DOX作为研究对象，观察西黄丸含药血清对乳腺癌耐药细胞增殖、凋亡的影响，为临床西黄丸联合化疗药物治疗乳腺癌提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 细胞及药物：多西他赛耐药的人乳腺癌细胞MDAMB-231/DOX获赠于中山大学宋尔卫教授实验室。西黄丸购自北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂(批号：15042125)。

1.2 试剂与仪器：DMEM/HIGH GLUCOSE培养液（美国HyClone公司，批号：AC10207065）；胎牛血清（美国Gibco公司，批号：15121250）；抗体（美国Proteintech公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：P0012）；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（美国biouniquer公司，批号：7E070F6）；CCK-8试剂（日本同仁公司，批号：KM868）。流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）；蛋白印记检测系统（美国Bio-Rad公司）；酶标仪（美国Thermo公司）。

1.3 细胞培养：细胞用含10%胎牛血清和100nmol/L多西他赛的DMEM培养基，于37℃、5%CO2恒温培养箱内培养，隔2～3d传代，细胞达到对数生长期进行实验。

1.4 西黄丸含药血清制备：西黄丸按0.6g/kg（MIDXHW），1.2g/kg（HIGHW）和给药液10ml/kg，蒸馏水组为对照组（Wistar大鼠4周龄200g，同为雌性）进行给药；早晚各1次，连续7天。于末次给药后1h（灌药前12h禁食）,以20%乌拉坦10ml/kg腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，无菌分离血清，经过56℃，30min灭活后，置-80℃箱保存备用。

1.5 MDA-MB-231/DOX细胞增殖检测：采用CCK-8原液∶培养基=1∶9配置成CCK-8工作液加入MDA-MB-231/DOX细胞孔板中，孵育1.5h后，在波长450nm处读取OD值。

1.6 MDA-MB-231/DOX细胞凋亡率检测：收集MIDHW组、HIGHW组和对照组处理48小时的MDA-MB-231/DOX细胞，置于离心管中，800´rpm离心5min，去上清液，按照Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒说明书操作，每管加入500μl缓冲液，依次加入5μl Annexin VFITC，5μl PI，室温避光孵育10min，采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.7 蛋白印迹法（Western blot）法检测：MIDHW组、HIGHW组和对照组处理48h后，每孔加入100ul含1%蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，转至于EP管中，12000´rpm离心10min，收集上清液。采用BCA法进行蛋白定量。加入适量SDS上样缓冲液于100℃金属浴解交联。取20μg蛋白样品，10%SDS-PAGE电泳，将电泳分离的蛋白质电转移至PVDF膜上，放入封闭液中室温封闭1h，加入一抗4℃孵育过夜。次日洗膜，二抗室温孵育1h，洗膜后，用蛋白印迹观察，用图像分析软件测定各带吸光度值作半定量分析。

1.8 统计学方法：所有实验重复3次，实验数据用graphpad prism5.0进行分析。两样本均数间比较用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 西黄丸含药血清有抑制MDA-MB-231/DOX细胞增殖的趋势：MIDHW组、HIGHW组和对照组西黄丸含药血清处理MDA-MB-231/DOX细胞48小时后。细胞增殖实验结果显示见图1。与对照组相比，MIDHW组和HIGXHW组增殖有受到抑制的趋势，呈剂量依赖性。

图1 西黄丸含药血清有抑制多西他赛耐药的MDA-MB-231/DOX细胞增殖活性的趋势

2.2 西黄丸含药血清有促进MDA-MB-231/DOX细胞凋亡的趋势：流式细胞仪检测MIDHW组、HIGHW组和对照组细胞凋亡率。数据显示，西黄丸含药血清有促进多西他赛耐药的MDA-MB-231细胞凋亡的趋势。见图2。与CTRL组相比，MIDHW组、HIGHW组的凋亡率逐渐升高（P＜0.01）。

图2 西黄丸含药血清有促进多西他赛耐药的MDA-MB-231/DOX细胞凋亡的趋势。

2.3 西黄丸含药血清增加Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白的表达：MDA-MB-231/DOX细胞经西黄丸含药血清处理后，Western blot检测Bcl-2蛋白和Bax蛋白的表达。采用图片处理软件进行半定量，发现与对照组相比，Bcl-2蛋白的表达量在MIDHW组、HIGHW组分别减少了40.1%、54.8%（P＜0.01），呈剂量依赖性；而Bax蛋白的表达量在MIDHW组、HIGHW组分别增加了41.2%、71.3%（P＜0.01），呈剂量依赖性。实验结果表明，西黄丸含药血清增加MDA-MB-231/DOX细胞的Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白。见图3。

图3 西黄丸含药血清促进Bax蛋白表达，并抑制Bcl-2蛋白

3 讨论

本研究通过制备西黄丸含药血清，观察其对多西他赛耐药的人乳腺癌细胞MDA-MB-231/DOX增殖的影响，发现西黄丸各组与对照组相比，细胞增殖能力有降低趋势，并呈剂量依赖性。细胞凋亡实验显示，西黄丸含药血清促进多西他赛耐药的MDA-MB-231/DOX细胞的凋亡，细胞凋亡率随西黄丸含药血清剂量增加而升高，与增殖实验结果相符。以上提示西黄丸有可能抑制了乳腺癌耐药细胞增殖，并促进细胞凋亡。并可促进Bax表达，抑制Bcl-2蛋白表达，提示西黄丸通过调控Bcl-2及Bax蛋白表达，从而使MDA-MB-231/DOX细胞产生凋亡的趋势，影响肿瘤细胞耐药性。综上，西黄丸有抑制乳腺癌MDA-MB-231/DOX细胞增殖的趋势，并可能通过上调Bax蛋白表达、下调Bcl-2蛋白，促进乳腺癌耐药细胞的凋亡。然而，细胞增殖实验中发现西黄丸含药血清有抑制耐药细胞增殖的趋势，但无统计学意义；且凋亡实验结果虽有统计学意义，但差异较小，故西黄丸对乳腺癌耐药细胞的作用及其调控机制仍然需进一步研究。