高效液相色谱法同时测定清热护肝方中葛根素、栀子苷和芍药苷的含量*

楼婷婷 余 平 孙萍萍 余永华

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

2 杭州新诺华医药有限公司 浙江 杭州 310015

清热护肝方由葛根、栀子、芍药、柴胡、枸杞、茵陈、五味子、板蓝根、垂盆草、紫草组成，具有清热解毒、保肝护肝的功效。其中葛根、栀子、芍药是其重要成分。目前，未见同时测定清热护肝方多个成分含量的报道。笔者采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定清热护肝方葛根中活性成分葛根素、栀子中活性成分栀子苷和芍药中活性成分芍药苷的含量，并进行方法学考察，以期为有效控制该制剂的质量提供参考。

1 仪器与试药

岛津LC-15C高效液相色谱仪；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）；十万分之一电子天平（德国塞多利斯）。葛根素、栀子苷和芍药苷的对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110752-200511、110749-200714、110736-201337）；水 为 过0.22μm滤膜的纯水，乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析醇。清热护肝方饮片均由浙江中医药大学中药饮片厂提供，经浙江中医药大学药学院专家鉴定合格。

2 方法[1-4]和结果

2.1 色谱条件：流动相为乙腈-水（16∶84），色谱柱为HypersilBDSC18（4.6mm× 250mm，5μm），流 速 为1.0ml/min，检测波长为230nm。进样量为20μl。理论板数按葛根素、栀子苷和芍药苷计算均在4000以上，分离度均＞1.5。对照品、样品、阴性样品色谱见图1。

2.2 对照品溶液的制备：分别取葛根素对照品约17mg、栀子苷对照品约10mg和芍药苷约14mg，置100ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备：按照处方，调配混合研细，精密称取细粉适量约500mg，置50ml容量瓶中，加甲醇25ml，超声提取40min，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，取续滤液即得。

图1 对照品(A)、样品(B)、阴性样品(C)HPLC色谱图

2.4 阴性对照溶液的制备：以相同处方比例，制得不含葛根、栀子、芍药的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制成空白对照溶液。

2.5 线性关系考察：分别精密量取浓度为170μg/ml的葛根素对照品溶液、100μg/ml的栀子苷对照品溶液、140μg/ml的芍药苷对照品溶液适量，加甲醇配成浓度为 0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012μg/ml的系列葛根素对照品溶液，0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006μg/ml的系列栀子苷对照品溶液，0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008μg/ml 的系列芍药苷对照品溶液。按上述色谱条件测定峰面积，并以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性回归，得线性方程：Y=2109500X+15080，r=0.9999；Y=29589000X-72694，r=0.9998；Y=1976500X-5798，r=0.9999。结果表明葛根素在0.002～0.012μg/ml，栀子苷在0.001～0.006μg/ml，芍药苷在0.003～0.008μg/ml范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.6 稳定性实验：取供试品溶液，按色谱条件，分别于0h、2h、4h、6h、8h、12h进行测定，计算供试品溶液葛根素、栀子苷和芍药苷的峰面积RSD。得葛根素、栀子苷和芍药苷峰面积的RSD分别为0.70%，0.93%，1.05%，表明样品溶液在12h内稳定。

2.7 精密度试验：精密吸取对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积，计算RSD。得葛根素、栀子苷和芍药苷峰面积的RSD分别为0.44%，0.61%，0.89%（n=6），结果表明本法精密度良好。

2.8 重复性试验：称取同一批次样品6份，按供试品溶液制备方法制备供试液并依法测定，实验结果显示葛根素、栀子苷和芍药苷含量的RSD分别为1.61%，1.79%，1.47%（n=6），结果表明重复性良好。

2.9 加样回收率试验：取已知含量的清热护肝方（含葛根素0.685mg/g、栀子苷0.396mg/g和芍药苷0.548mg/g）样品适量，研细，取9份，每份约250mg，置50ml量瓶中，精密加入对照品溶液1ml，加甲醇22ml，超声处理40min，放冷至室温，用甲醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，按上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表1～表3。

表1 葛根素加样回收率测定结果（n=9）

表2 栀子苷加样回收率测定结果（n=9）

表3 芍药苷加样回收率测定结果（n=9）

2.10 样品的测定：按供试品溶液项下制备方法和色谱条件对3批样品中葛根素、栀子苷和芍药苷进行分析，计算含量，结果见表4。

表4 每片样品中各成分含量测定结果（n=3）

3 讨论

本法采用乙睛-水进行洗脱，简便方便，基线平稳。分别对比例为13.5∶86.5、16∶84、17∶83进行考察，随着乙睛比例的升高，保留时间缩短，但葛根素分离不完全，流动相的比例为16∶84时，分离效果较好。葛根素最大吸收波长为250nm，栀子苷最大吸收波长为240nm，芍药苷最大吸收波长为230nm，栀子苷色谱峰面积比芍药苷和葛根素大很多，在230nm处三个吸收峰均较好，兼顾三种成分的同时测定灵敏度，选择230nm作为检测波长。本文HPLC法同时测定清热护肝方中葛根素、栀子苷和芍药苷的含量方法可行，结果精密度高，重现性好，样品回收率好，可为该制剂质量控制提供依据。

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