原发性肝细胞癌患者血清中微小RNA-21、微小RNA-122和微小RNA-145的表达及临床意义

尚 冰，陈 炜

(铜川矿务局中心医院外科，陕西 铜川 727000)

原发性肝癌主要指肝细胞癌、肝内胆管癌和肝血管肉瘤，其中，肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的85%～90%，在肿瘤相关死亡原因中居第3位[1]。HCC的发展和恶化是一个典型的多阶段过程，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是HCC的重要病因[2]。HCC的进展与许多调节细胞周期、细胞凋亡和细胞迁移等的基因有关。诸多研究聚焦于与HCC进展相关的基因和蛋白质，但是其敏感性和特异性尚不尽人意[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类由19～24个核苷酸组成的小型非编码RNA，通过与mRNA靶位点结合，在翻译水平调节基因表达[4-5]。研究表明，miRNA异常表达与多种癌症的发生和进展有关[6]。研究显示，肝胆管细胞癌组织中miR-21表达显著上调，miR-122和miR-145表达显著下调，这3种miR可能参与了肝癌的发生和发展[7]。本研究旨在探讨HCC患者血清中miR-21、miR-122和miR-145的表达及临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料选择2014年9月至2016年9月铜川矿务局中心医院收治的HCC患者，患者纳入标准：(1)经病理学检查确诊为HCC；(2)符合HCC诊断标准[8]；(3)入组前均未接受任何治疗；(4)精神状况良好。排除标准：(1)伴有严重营养不良者；(2)不愿意参加本研究者。本研究共纳入HCC患者100例(HCC组)，男53例，女47例，年龄41～65(50.45±8.26)岁。另外，选择同期体检健康者100例作为对照组，男50例，女50例，年龄40～65(50.35±9.12)岁。2组受试者的性别、年龄分布比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会审查、同意后实施，受试者均签署知情同意书。

1.2主要试剂与仪器TaqMan®ABC miRNA Purification Kit(美国Thermo Fisher公司)，反转录试剂盒、热启动Taq 酶(日本TAKARA公司)；7500型荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)仪(美国ABI公司)。

1.3血样采集HCC患者分别于入院时和手术后1周采集空腹肘静脉血5 mL，对照组受试者于体检当日采集空腹肘静脉血，将血样装于5 mL离心管中，室温下静置1 h，然后3 000 r·min-1离心5 min，取上清液，置于-70 ℃冰箱中保存。

1.42组受试者血清中miR-21、miR-122和miR-145表达检测采用实时定量荧光PCR法检测血清中miR-21、miR-122和miR-145的表达。首先，采用TaqMan®ABC miRNA Purification Kit试剂盒提取细胞总RNA。其次，根据目标基因的mRNA 序列，按照引物设计的原则，用设计软件Primer express 3.0设计并合成引物及探针。miR-21的上游引物序列为5′-GCTTCGCCTAGCTTATCAGACT-3′，下游引物序列为5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′；miR-122的上游引物序列为5′-CAAGCGTTGGAGTGTGACA-3′，下游引物序列为5′-CGTCCTACCATTCTCCAGC-3′；miR-145的上游引物序列为5′-GCTGGGGTCCA-GTTTTCCCAGGA-3′，下游引物序列为5′-GTCGGCAATTCAGTTGAGAGGGATTC-3′；内参基因U6的上游引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA-TACT-3′，下游引物序列为5′-ACGCTTCACGAA-TTTGCGTGTC-3′。进行RNA反转录后，以反转录产物为模板，在实时定量PCR仪上进行扩增，反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s，65 ℃ 40 s，循环35次。采用2-△△CT法计算miR-21、miR-122和miR-145的相对表达量。

2 结果

2.12组受试者血清中miR-21、miR-122和miR-145表达水平比较结果见表1。HCC组患者血清中miR-21、miR-122表达水平显著高于对照组，miR-145表达水平显著低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表12组受试者血清中miR-21、miR-122和miR-145表达比较

2.2血清中miR-21、miR-122和miR-145表达水平与HCC患者临床特征的关系结果见表2。HCC患者血清中miR-21、miR-122和miR-145表达水平与组织分化程度、临床分期、肿瘤大小及肝硬化有关(P<0.05)，与性别、年龄、HBV抗原、HCV抗体无关(P>0.05)。与高分化和中分化程度、临床分期低、肿瘤直径<5cm和无肝硬化的患者相比，低分化程度、临床分期高、肿瘤直径≥5 cm和有肝硬化的患者血清中miR-21和miR-122表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表2血清miR-21、miR-122和miR-145表达与HCC临床特征的关系

2.3HCC患者手术前后血清中miR-21、miR-122和miR-145表达水平比较结果见表3。手术后HCC患者血清中miR-21、miR-122表达水平显著低于手术前，miR-145表达水平显著高于手术前，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表3肝癌患者手术前后血清中miR-21、miR-122和miR-145表达比较

3 讨论

miRNA在多种肿瘤中异常表达，且其表达水平与肿瘤的进展和预后高度相关[9]。原发性肝癌是常见的恶性肿瘤之一，我国每年有近50万人死于肝癌[10]。目前，甲胎蛋白作为肝癌患者筛查的手段，其敏感度较低，且区分肝癌与乙型肝炎或肝硬化的能力较差[11]。因此，研究miRNA在肝癌诊断及预后评估中的作用具有重要的临床意义。

miR-21首次在神经胶质瘤中被发现，是一种致癌miRNA，通过抑制细胞凋亡而促进肿瘤的发生和发展。miR-21在多种肿瘤中存在过表达现象，包括乳腺癌[12]、肺癌[13]、结直肠癌[14]、肾癌[15]等。本研究结果显示，HCC患者血清中miR-21表达水平显著高于健康者。研究表明，miR-21的表达水平与乳腺癌和宫颈癌的淋巴转移、临床分期等具有明显相关性，且随着临床分期的升高，miR-21表达水平逐渐升高[16]。miR-122是第1个被发现的肝脏特异性表达miRNA分子，且该miRNA约占肝脏所表达miRNA分子总量的70%[17]。miR-122表达水平与细胞周期蛋白G1呈负相关，并且G1是miR-122 的作用靶点，miR-122在肿瘤细胞中过表达，具有促进肿瘤细胞增殖的作用[18]。SHYU等[19]研究显示，肝癌组织中miR-122表达水平显著高于癌旁组织。本研究结果显示，HCC患者血清中miR-122表达水平显著高于健康者。与高分化和中分化程度、临床分期低、肿瘤直径<5cm和无肝硬化的患者相比，低分化程度、临床分期高、肿瘤直径≥5 cm和有肝硬化的患者血清中miR-21、miR-122表达显著升高，提示miR-21、miR-122可能成为HCC诊断、病情评估的指标。

miR-145具有高度的保守性、时序性和组织特异性，其通过调控下游的靶基因而参与肿瘤细胞的生长、增殖、分化、凋亡及转移扩散过程。何涛等[20]研究发现，miR-145在肝癌HepG2细胞系中的表达水平显著低于正常肝细胞。本研究结果显示，HCC患者血清中miR-145表达水平显著低于健康者。WANG等[21]研究发现，miR-145表达下调与非小细胞肺癌的淋巴结转移有关。本研究结果显示，miR-145的相对表达量在低分化程度、高临床分期、肿瘤直径<5 cm和并发肝硬化的患者中显著降低，提示miR-145的表达可能与肝癌的发生发展存在负相关关系。

综上所述，HCC患者血清中miR-21、miR-122高表达，miR-145低表达，且其表达水平与HCC患者的临床分期、分化程度、肿瘤大小和是否有肝硬化具有相关性。此3种miRNA可能参与了HCC的发生和发展，联合检测血清中miR-21、miR-122和miR-145表达水平有助于HCC的诊断和病情评估有重要意义。

[1] TORRE L A，BRAY F，SIEGEL R L，etal.Global cancer statistics，2012[J].CACancerJClin，2015，65(2)：87-108.

[2] ARZUMANYAN A，REIS H M，FEITELSON M A.Pathogenic mechanisms in HBV-and HCV-associated hepatocellular carcinoma[J].NatRevCancer，2013，13(2)：123-135.

[3] NORTON P，COMUNALE M A，HERRERA H，etal.Development and application of a novel recombinant Aleuria aurantia lectin with enhanced core fucose binding for identification of glycoprotein biomarkers of hepatocellular carcinoma[J].Proteomics，2016，16(24)：3126-3136.

[4] 党晓洁，任梅，朱江，等.氧化应激条件下miR-21对人眼小梁网细胞胞外基质蛋白表达的影响[J].眼科新进展，2017，37(1)：30-34.

[5] 符春艳.miR-93及miR-21在糖尿病视网膜病变患者中的表达及其临床价值[J].眼科新进展，2017，37(12)：1161-1164.

[6] NARASIMHAN A，GHOSH S，STRETCH C，etal.Small RNAome profiling from human skeletal muscle：novel miRNAs and their targets associated with cancer cachexia[J].JCachexiaSarcopeniaMuscle，2017，8(3)：405-416.

[7] KARAKATSANIS A，PAPACONSTANTINOU I，GAZOULI M，etal.Expression of microRNAs，miR-21，miR-31，miR-122，miR-145，miR-146a，miR-200c，miR-221，miR-222，and miR-223 in patients with hepatocellular carcinoma or intrahepatic cholangiocarcinoma and its prognostic significance[J].MolecularCarcinogenesis，2013，52(4)：297.

[8] 中国抗癌协会肝癌专业委员会，中华医学会肝病学分会肝癌学组，中国抗癌协会病理专业委员会，等.原发性肝癌规范化病理诊断指南：2015年版[J].中华肝胆外科杂志，2015，21(3)：145-151.

[9] RAWLINGS-GOSS R A，CAMPBELL M C，TISHKOFF S A.Global population-specific variation in miRNA associated with cancer risk and clinical biomarkers[J].BMCMedGenomics，2014，7(1)：53.

[10] 任同良.微波消融与手术切除治疗原发性肝癌疗效比较[J].新乡医学院学报，2017，34(11)：991-993，997.

[11] SHU H，LI W，SHANG S，etal.Diagnosis of AFP-negative early-stage hepatocellular carcinoma using Fuc-PON1[J].DiscovMed，2017，23(126)：163-168.

[12] SORIA-VALLES C，GUTIéRREZ-FERNNDEZ A，GUIU M，etal.The anti-metastatic activity of collagenase-2 in breast cancer cells is mediated by a signaling pathway involving decorin and miR-21[J].Oncogene，2014，33(23)：3054-3063.

[13] LI B，REN S，LI X，etal.miR-21 overexpression is associated with acquired resistance of EGFR-TKI in non-small cell lung cancer[J].LungCancer，2014，83(2)：146-153.

[14] SHI C，YANG Y，YANG X，etal.Novel evidence for an oncogenic role of microRNA-21 in colitis-associated colorectal cancer[J].Gut，2016，65(9)：1470-1481.

[15] VERGHO D，KNEITZ S，ROSENWALD A，etal.Combination of expression levels of miR-21 and miR-126 is associated with cancer-specific survival in clear-cell renal cell carcinoma[J].BMCCancer，2014，14：25.

[16] 祝敏捷，孙莲芳，杨静.血清miR-21和miR-10b在早期宫颈癌患者中的表达及临床意义[J].现代中西医结合杂志，2017，26(11)：1167-1170.

[17] SONG K，HYUNJOO K，HAN C，etal.Active glycolytic metabolism in CD133+hepatocellular cancer stem cells：regulation by miR-122[J].Oncotarget，2015，6(38)：40822-40835.

[18] XING T J，JIANG D F，HUANG J X，etal.Expression and clinical significance of miR-122 and miR-29 in hepatitis B virus-related liver disease[J].GenetMolRes，2014，13(3)：7912-7918.

[19] SHYU Y C，LEE T L，LU M J，etal.miR-122-mediated translational repression of PEG10 and its suppression in human hepatocellular carcinoma[J].JTranslMed，2016，14(1)：200.

[20] 何涛，李国庆，谢娟，等.miR-145对HepG2细胞中肿瘤干细胞增殖的影响[J].中国医药指南，2013，11(31)：62-63.

[21] WANG M，WANG J，DENG J，etal.miR-145 acts as a metastasis suppressor by targeting metadherin in lung cancer[J].MedOncol，2015，32(1)：344.