不同种类腐乳游离脂肪酸组成分析及营养评价

解春芝，曾海英，宋 杰，秦礼康*

（1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 明德学院，贵州 贵阳 550025）

腐乳源于中国，至今已有一千多年的生产历史，与豆豉、酱油、豆酱并称为我国四大传统发酵调味品[1]，因其质构与奶酪相似，故又被欧美誉为“中国干酪”[2]。腐乳营养丰富、味道鲜美、风味独特、品种多样，倍受消费者青睐，年产量逾300 000 t[3]。根据前酵菌种类型可分为毛霉型腐乳、细菌型腐乳、自然发酵型腐乳以及酶促型腐乳；根据色泽风味分类，可分为红腐乳、白腐乳、青腐乳、酱腐乳和各种花色腐乳；根据规格形状又可分为太方腐乳、行方腐乳、醉方腐乳、中方腐乳、棋方腐乳[2，4]。

脂肪作为腐乳中重要组成部分，约占腐乳干质量的20%～30%[5]。在发酵过程中，大量微生物分泌的酶系将脂肪分解成脂肪酸和甘油，是腐乳独特风味和细腻滑嫩质构形成物质之一。作为腐乳风味形成的重要前体物质，脂肪酸氧化产生的风味物质主要是醛类、酮类、醇类、羧酸类、呋喃类等[6]。此外，大量研究表明，摄入适当比例的饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸，可预防心脑血管疾病、癌症、关节炎，降低炎症和结肠炎的发病率[7-8]。

目前，针对腐乳脂肪酸的报道较少，仅局限于1～3种市售腐乳或自制腐乳[9-10]，限制了人们对不同腐乳脂肪酸营养价值的整体认知。本课题根据前酵菌的不同，采集了不同类型的8种腐乳，通过气-质联用仪（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）测定腐乳游离脂肪酸的种类和含量，采用主成分分析法（principalcomponentanalysis，PCA）分析其脂肪酸组成差异，综合评价其营养价值，以期为腐乳生产工艺改善及消费者选购提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集的8种腐乳样品，分属于细菌型、毛霉型以及自然发酵型腐乳三大类型，源于全国各地，样品信息见表1。其中，作为中国腐乳主要类型的毛霉型腐乳样品包括了红方（RS）、白方（WS）、青方（GS）、酱方（JS）和花色腐乳（糟方腐乳，ZS；白菜腐乳，CS）。细菌型腐乳和自然发酵型腐乳分别以克东腐乳（KS）和贵州土腐乳（SS）为代表。

硫酸、甲醇、正己烷、无水硫酸钠、氢氧化钾、乙醇、酚酞、石油醚（均为分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司。

表1 不同腐乳样品信息Table 1 Details of different sufu varieties

1.2 仪器与设备

HP6890/5975C GC-MS联用仪：美国安捷伦科技公司；FD-1A-50冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；SER148全自动脂肪提取仪：意大利威尔普公司；GZX-9140MBE数显鼓风干燥箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

同种腐乳5瓶样品中各取出100 g腐乳块（共500 g），于蒸馏水中5 min洗去表层辅料，放漏斗上沥干水分，去除表皮（0.5 cm）后混料进行冷冻干燥，再研磨过60目筛，称取适量冷冻干燥过的腐乳样品，采用全自动索氏抽提仪提取脂肪，并于红外烘箱干燥至质量恒定，-20℃储存备用。

1.3.2 总游离脂肪酸测定

总游离脂肪酸测定参考标准NY/T 1797—2009《油菜籽中游离脂肪酸的测定》，样品预处理略有改动，见1.3.1。

1.3.3 游离脂肪酸测定[11]

样品的甲酯化：称取腐乳抽提的油脂样品约30 mg，放入密封瓶中，加1%硫酸甲醇溶液2 mL，在70℃恒温箱中加热1 h甲酯化后，加入2 mL正己烷萃取，超声振荡，静置，取上清液，用纯水洗涤至中性，加入无水硫酸钠1 g（吸水），浓缩至1 mL备用。

色谱条件：色谱柱为ZB-5MSI 5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷弹性石英毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱温60℃，保持2 min，以10℃/min升温至160℃，再以5℃/min升温至300℃，运行40 min；汽化室温度为250℃；载气为高纯氦气（99.999%）；柱前压7.62 psi；载气流速1.0 mL/min；分流比20∶1，溶剂延迟时间为5.0 min，进样量1 μL。

离子源为电子电离（electron ionization，EI）源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70 eV；发射电流34.6 μA；倍增器电压1 718 V；接口温度280℃；质量扫描范围29～500 amu。

将总离子流图中的各峰进行质谱计算机数据系统检索，并核对Nist2005和Wiley275标准质谱图，确定脂肪酸，用峰面积归一化法计算各脂肪酸的相对质量分数。并计算出不同腐乳中饱和脂肪酸（saturated fatty acid，SFA），单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA），多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），不饱和指数（unsaturation index，UI），动脉粥样硬化指数（atherogenic index，AI）以及血栓指数（thrombogenic index，TI）。各指标的计算公式如下：

SFA=C14:0+C15:0+C16:0+C17:0+…+C25:0；

MUFA=C16:1 n-7+C18:1 n-9+C20:1 n-9；

PUFA=C18:2 n-6；

UI=1×单烯酸含量（%）+2×二烯酸含量（%）+3×三烯酸含量（%）+…n×n烯酸含量（%）；

AI=[C12:0+（4×C14:0）+C16:0]/（MUFAs+n-3 PUFAs+n-6 PUFAs）；

TI=（C14:0+C16:0+C18:0）/[（0.5×MUFAs）+（0.5×n-6 PUFAs）+（3 × n-3 PUFAs）+（n-3 PUFAs/n-6 PUFAs）]。

1.3.4 数据分析

数据采用SPSS20.0软件进行数据处理和主成分分析。在方差分析结果显著时，采用Duncan法进行多重比较。经PCA提取出主成分后，计算主成分特征值和累积贡献率，并以每个主成分所对应的特征值的方差贡献率作为权数，构建综合评价模型。

2 结果与分析

2.1 不同腐乳中总游离脂肪酸含量

不同腐乳样品中总游离脂肪酸的含量见图1。

图1 不同腐乳中总游离脂肪酸的含量Fig.1 Total free fatty acid contents of different sufu varieties

由图1可知，白菜腐乳CS总游离脂肪酸含量最高，达18.85 g/100 g，其次为红腐乳RS（16.82 g/100 g）和青腐乳GS（15.68g/100g）。细菌型KS（8.09 g/100 g）总游离脂肪酸含量最低，仅为CS的43%。由此可知，不同种类腐乳游离脂肪酸的含量差异显著，即使同种腐乳，发酵时间不同，脂肪酸含量也存在差别。究其原因，一方面，制作腐乳的原料大豆和辅料中脂肪及游离脂肪酸含量原本存在差异[12]，如细菌型腐乳KS主要以东北春大豆为原料，自然发酵型腐乳SS主要以云贵高原夏大豆为原料，而毛霉型腐乳由于分布广泛，其原料都来源也较为多样，包括黄淮海平原和长江流域夏大豆等；另一方面，不同腐乳微生物区系不同，脂肪酶活力具有差异，进而导致脂肪的降解程度也不尽相同。有报道表明，在前酵培菌阶段，细菌型腐乳以藤黄微球菌（Micrococcus luteus）为主，蛋白酶活力较高[13]，而毛霉型腐乳以五通桥毛霉、雅致放射状毛霉、腐乳毛霉、总状毛霉为主，总状毛霉分泌脂肪酶活力最强，可达到119.2U/g，且酶活力大小依次为总状毛霉＞雅致放射状毛霉＞五通桥毛霉＞腐乳毛霉[14]。此外，14碳以上的高级饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸在常温下状态不同，其含量的高低和种类的多少密切影响着脂肪的结构，性质及脂肪晶形等，进而影响腐乳的微观结构[15]。因此，发酵过程中游离脂肪酸的释放，有益于腐乳细腻质构的形成。

2.2 不同腐乳游离脂肪酸含量

表2 不同腐乳游离脂肪酸含量和营养评价指标Table 2 Free fatty acid profiles and nutrition evaluation indexes of different sufu varieties

不同腐乳游离脂肪酸含量见表2，共检测出15种游离脂肪酸，其种类相似而含量差异显著（P＜0.05）。根据饱和度分类，所测游离脂肪酸可分为饱和脂肪酸（SFA）、单不饱和脂肪酸（MUFA）和多不饱和脂肪酸（PUFA）。其中SFA包括：肉豆蔻酸（C14:0）、十五烷酸（C15:0）、棕榈酸（C16:0）、十七烷酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、二十烷酸（C20:0）、二十一烷酸（C21:0）、山嵛酸（C22:0）、二十三烷酸（C23:0）、木蜡酸（C24:0）和二十五烷酸（C25:0）。肉豆蔻酸是人体内主要的SFA，与血清中胆固醇含量呈正相关，可能是导致胆固醇升高的最主要因子[16]，但也可减少前列腺增生发生几率[17]。而棕榈酸作为腐乳最主要的SFA，其比重为10.99%～13.72%。但饮食中过多的摄入棕榈酸，可抑制脂肪氧化和能量消耗，进而可能增大肥胖和胰岛素抵抗风险[18]。MUFA包括棕榈油酸（C16:1n-7）、油酸（C18:1n-9）和11-二十碳烯酸（C20:1n-9），其中含量最丰富的为油酸（22.29%～28.16%）。研究表明，油酸不仅可软化血管，在人和动物的新陈代谢过程中起着重要作用，还可减缓食品中油脂结晶化[19]。亚油酸（C18:2）是腐乳中唯一的PUFA，同时也是腐乳中最为丰富的脂肪酸，百分含量高达43.36%～50.74%。研究发现，亚油酸可降低氧化损伤，通过与胆固醇结合，还可维持血液胆固醇正常的运转和代谢。膳食中亚油酸的缺乏，可增大饱和脂肪酸与胆固醇结合的几率，促进动脉粥样硬化，进而引发心脑血管相关疾病[20]。KIM J S等[11]对中国不同腐乳进行研究，同样发现亚油酸（830 mg/100 g鲜样）含量最为丰富，油酸和棕榈酸次之。此外，油酸和亚油酸不仅是必需要脂肪酸，也可与醇类物质发生酯化反应生成酯类物质，对腐乳中酸味、果香等独特风味物质生成具有重要贡献[21-22]。

由表2可知，在8种腐乳中，SFA含量均较低，占比分布在16.84%～19.39%，含量最高的为SS，含量最低的为ZS。不饱和脂肪酸作为主要脂肪酸，其中MUFA百分含量为22.67%～28.34%，PUFA为43.36%～50.74%。不同腐乳PUFA/SFA比值差异不显著（P＞0.05），最大的为KS（2.83）。而PUFA/MUFA比值分布在1.53～2.11之间，最大的为KS，最小的为ZS。脂肪酸比值对人体健康具有重要意义，高PUFAs/SFAs值有利于血清胆固醇和动脉粥样硬化的减少，并可预防心脏疾病[23]。PUFA/SFA比值作为评价油脂质量的重要指标，推荐最低值为0.45[24]。所有腐乳的PUFA/SFA比值远远高于0.45，说明腐乳的各脂肪酸比例合理。

脂肪酸和人体健康密切相关，不饱和指数（UI）作为评价脂肪酸饱和程度的一个重要指标，与Ⅱ-型糖尿病具有一定的关联度。而动脉粥样硬化指数（AI）和血栓指数（TI）越高，越易于患相关的疾病，对人体的潜在危害越大[24]。腐乳UI指数为112.17～127.05，AI（0.16～0.19）和TI（0.42～0.50）指数均低于0.5，远远低于药用海藻相关指数（AI：0.94～1.99；TI：0.46～1.60）[24]。腐乳中UI、AI和TI指数相对合理，可能源于亚油酸含量较高，对预防Ⅱ-型糖尿病和心脑血管疾病具有潜在意义。

2.3 腐乳游离脂肪酸主成分分析

主成分分析法是多元统计中的一种数据挖掘技术，利用降维的原理，在保留主要变量信息的前提下，可把多个指标转化为几个不相关的综合变量[25]。主成分分析在满足数据降维的同时，能够客观地确定各个指标的权重，避免了主观随意性，具有一定的优越性[26]。因此，已被广泛应用于食品品质分析中[27-28]，主成分的特征值和贡献率见表3。由表3可知，前3个主成分的贡献率分别为68.626%、26.251%、3.834%，累计贡献率为98.711%，确定提取3个主成分最合适，可较好反映所有游离脂肪酸组成的基本信息。

表3 主成分的特征值和贡献率Table 3 Eigenvalues and contribution rate and of the principal components

表4 主成分的载荷矩阵Table 4 Loading matrix of principal components

主成分的载荷矩阵见表4。由表3和4各特征向量值可知，第1主成分PC1主要反映C18:2的变异信息，故可将PC1命名为多不饱和脂肪酸因子F1。第2主成分PC2主要反映C18:1和C16:1的变异信息，故可将PC2命名为单不饱和脂肪酸因子F2。第3主成分PC3主要反映C16:0、C18:0、C22:0，C17:0、C14:0、C15:0和C24:0等的变异信息，故可将PC3命名为饱和脂肪酸因子F3。

2.4 腐乳脂肪酸组成比例综合评价

由于PCA中前3个主成分反映了15个指标变量信息的98.711%，说明利用前3个主成分进行不同腐乳的游离脂肪酸的评价是可行的，可用F1（多饱和脂肪酸因子）、F2（单不饱和脂肪酸因子）、F3（饱和脂肪酸因子）3个新的综合指标来替代原来的15个指标对腐乳脂肪酸进行分析，得到前3个主成分的线性关系式分别为：

主成分越重要，方差贡献率越大，以每个主成分所对应的方差贡献率为权重，构建综合评价模型F=0.686F1+0.263F2+0.038F3，计算各样品综合得分，然后进行排序评价各个样本的游离脂肪酸组成。得分如表5所示，游离脂肪酸组成比例分值排序为JS＞KS＞WS＞SS＞GS＞ZS＞RS＞CS，即酱腐乳＞克东腐乳＞白腐乳＞贵州土腐乳＞青腐乳＞糟方腐乳＞红腐乳＞白菜腐乳。说明不同游离脂肪酸综合质量存在差异，JS腐乳的游离脂肪酸综合质量最高。

表5 腐乳的成分得分和综合得分Table 5 Principal component scores and comprehensive scores of 8 sufu varieties

3 结论

不同腐乳中总游离脂肪酸差异显著（P＜0.05），花色腐乳CS中总游离脂肪酸含量高达18.85 g/100 g，约为细菌型腐乳KS的2倍。GC-MS测定了8种腐乳中游离脂肪酸谱，共检出15种游离脂肪酸，其中亚油酸、油酸和棕榈酸为主要脂肪酸。PUFA/SFA比值最大的为KS（2.83），最小的为SS和RS，均为2.41。所有腐乳的PUFA/SFA比值远远高于推荐值0.45，说明腐乳的各脂肪酸比例合理，对健康具有重要意义。基于主成分分析法，提取得到的前三个主成分的贡献率分别为68.626%、26.251%、3.834%，累计贡献率达到98.711%，可较好反映所有游离脂肪酸组成的基本信息。根据建立的综合评价模型可知游离脂肪酸组成比例分值排序为酱腐乳＞克东腐乳＞白腐乳＞贵州土腐乳＞青腐乳＞糟方腐乳＞红腐乳＞白菜腐乳。主成分分析法可有效对不同腐乳的游离脂肪酸组成比例进行综合评价，但如果需要筛选出综合品质好的腐乳品种，除了考虑脂肪酸的含量和比例之外，还需对其他营养素进行综合分析，才能为腐乳生产工艺改善提供更为科学全面的依据。

[1]LI Y,YU R,CHOU C.Some biochemical and physical changes during the preparation of the enzyme-ripening sufu,a fermented product of soybean curd[J].J Agr Food Chem,2010,58(8):4888-4893.

[2]HANBZ,BEUMERR R,ROMBOUTS FM,et al.Microbiological safety and quality of commercial sufu-a Chinese fermented soybean food[J].Food Control,2001,12(8):541-547.

[3]XIA X,LI G,ZHENG J,et al.Biochemical,textural and microstructural changes in whole-soya bean cotyledon sufu during fermentation[J].Int J Food Sci Tech,2014,49(8):1834-1841.

[4]HAN B,ROMBOUTS F M,NOUT M J R.A Chinese fermented soybean food[J].Int J Food Microbiol,2001,65(1-2):1-10.

[5]马 勇，韩北忠，王家槐.腐乳生产过程中食盐对蛋白质、脂肪水解的影响[J].中国酿造，2002，21（1）：15-18.

[6]JEONGHO S,OHSHIMA T.Control of lipid oxidation and meat color deterioration in skipjack tuna muscle during ice storage[J].Fisheries Sci,2010,76(4):703-710

[7]ABEDI E,SAHARI M A.Long-chain polyunsaturated fatty acid sources and evaluation of their nutritional and functional properties[J].Food Sci Nutr,2014,2(5):443-463.

[8]SHUKLA S,HEGDE S,KUMAR A,et al.Fatty acid composition and antibacterial potential ofCassia tora(leaves and stem)collected from different geographic areas of India[J].J Food Drug Anal,2017,2017:1-5.[9]周 荧，潘思轶.腐乳发酵过程中化学组分与质构的变化[J].食品科学，2011，32（1）：70-73.

[10]邹丽宏，杨跃峰，孙冰玉，等.克东腐乳生产过程中化学组分变化研究[J].食品工业科技，2014，35（6）：94-97.

[11]KIM J S,LU Y,CHUNG H Y.Chemical and textural properties in commercial fermented soybean curds of sufu[J].Prev Nutr Food Sci,2011,16(16):55-61.

[12]MARIAJOHNKM,NATARAJANS,LUTHRIADL.Metabolitechanges in nine different soybean varieties grown under field and greenhouse conditions[J].Food Chem,2016,211:347-355.

[13]孙冰玉，邹丽宏，刘 颖，等.克东腐乳生产过程中酶活力的变化[J].中国食品学报，2015，15（6）：226-230.

[14]冉春霞，阚建全.全豆腐乳发酵菌种选择的试验研究[J].中国调味品，2015，40（8）：1-4.

[15]FOUBERT I,VEREECKEN J,SMITH K W,et al.Relationship between crystallization behavior,microstructure,and macroscopic properties in trans containing and trans free coating fats and coatings[J].J Agr Food Chem,2006,54(19):7256-7262.

[16]TEMME E H,MENSINK R P,HORNSTRA G.Effects of medium chainfattyacids(MCFA),myristic acid,and oleic acid on serum lipoproteins in healthy subjects[J].J Lipid Res,1997,38(9):1746-1754.

[17]VEERESH B S V,VEERESH B,PATIL A A,et al.Lauric acid and myristic acid prevent testosterone induced prostatic hyperplasia in rats[J].Eur J Pharmacol,2010,626(2-3):262-265.

[18]KIEN C L,BUNN J Y,UGRASBUL F.Increasing dietary palmitic acid decreasesfatoxidationanddailyenergyexpenditure[J].Am J Clin Nutr,2005,82(2):320-326.

[19]BAYARD M,LEALCALDERON F,CANSELL M.Free fatty acids and their esters modulate isothermal crystallization of anhydrous milk fat[J].Food Chem,2017,218(2):22-29.

[20]KIM J H,KIM Y,KIM Y J,ET AL.Conjugated linoleic acid:potential health benefits as a functional food ingredient[J].Annu Rev Food Sci Tech,2016,7(1):221-245.

[21]CHUNG H Y,FUNG P K,KIM J.Aroma impact components in commercial plain sufu[J].J Agr Food Chem,2005,53(5):1684-1691.

[22]CHOU C C,HWAN C H.Effect of ethanol on the hydrolysis of protein and lipid during the ageing of a Chinese fermented soya bean curd-Sufu[J].J Sci Food Agr,1994,66(3):393-398.

[23]陈聪颖，唐年初，崔 淼，等.巴马火麻仁的组分测定及营养评价[J].食品工业科技，2011，32（12）：435-437.

[24]ULBRICHT T L V,SOUTHGATE D A T.Coronary heart disease:seven dietary factors[J].Lancet,1991,338(8773):985-992.

[25]谢丽源，郑林用，彭卫红，等.不同包装膜处理杏鲍菇品质的主成分分析与综合评价[J].食品工业科技，2016，37（13）：238-244.

[26]WANG Z,JABLONSKI J E.Targeted and non-targeted detection of lemon juice adulteration by LC-MS and chemometrics[J].Food Addit Contam A,2016,33(3):560-573.

[27]李俊芳，马永昆，张 荣，等.不同果桑品种成熟桑椹的游离氨基酸主成分分析和综合评价[J].食品科学，2016，37（14）：132-137.

[28]SZYMCZYCHA-MADEJA A,WELNA M,POHL P.Comparison and validation of different alternative sample preparation procedures of tea infusions prior to their multi-element analysis by FAAS and ICP OES[J].Food Anal Method,2016,9(5):1-14.