发酵条件对5种产酯酵母酒精发酵和产酯的影响

邢 爽，王亚平，郭学武，魏志阳，孙中贯，肖冬光*

（天津科技大学 生物工程学院 工业发酵微生物教育部重点实验室 天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

白酒是我国传统的蒸馏酒，历史悠久。白酒中的风味物质包括酸、酯、醇、醛和其他五大类，其中酯类物质所占比例最大。在各种香型白酒中，乙酸乙酯是分布最广泛的一种酯类物质，尤其是对清香型、老白干香型、凤香型等白酒，乙酸乙酯是构成其主体香味成分的重要物质[1-3]。

产酯酵母又称为生香酵母，是指产酯能力强的酵母菌总称，主要产乙酸乙酯，多属于产膜酵母，包括假丝酵母、汉逊酵母、毕赤酵母、球拟酵母等。在白酒生产中，其参与酿造发酵，是形成白酒香味成分的主要菌群[4-6]。产酯酵母的应用与相关研究始于20世纪60年代，张宏伟等[7]将培养成熟的产酯酵母拌入酒醅中蒸馏，既不影响正常酒率，又能明显增香；宋玉华等[8]在清香酒生产中添加固体产酯酵母入池发酵，乙酸乙酯含量明显提高，且酒质甘爽余味长，清香风格明显；刘桂君等[9]在液态发酵生产白酒时用生香酵母与红曲、酿酒酵母共同发酵，所获白酒乙酸乙酯的含量有较大幅度提高，酒的口味和香气均有改善。

酵母菌的酒精发酵和产酯与很多因素有关，包括发酵培养基、温度、pH、供氧情况等。酿酒酵母属兼性厌氧菌，可在无氧条件下生长与代谢，而大多数生香酵母则需在有氧条件下生长代谢[10]。王瑞明等[11]的研究表明，氧气对异汉逊酵母酯类代谢起着很重要的作用。目前关于供氧情况对产酯酵母影响的研究较少，且白酒生产中发酵温度和pH是极为重要的发酵条件，直接影响优质白酒的生产，因此研究供氧情况、pH、温度对产酯酵母的具体影响，对于产酯酵母在白酒生产中的应用是有必要的，且对于白酒生产具有指导意义。鉴于此，本实验拟对白酒厂中常用的几种产酯酵母一同进行研究，探究供氧情况、pH和温度对其酒精发酵和产酯的影响，以了解各种产酯酵母在不同发酵条件下酒精发酵和代谢产酯的规律，为产酯酵母在白酒生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

卡特多菲毕赤酵母（Pichia cactophila）、克鲁斯假丝酵母（Candida krusei）、汉逊酵母（Hansenula anomala）、球拟酵母（Torulopsis globosa）：工业发酵微生物教育部重点实验室保存。

高产酯酿酒酵母MY-15（CGMCC No.5635）：本研究室选育，工业发酵微生物教育部重点实验室保存。

1.1.2 原料与主要试剂

澳洲高粱：由某酒厂提供；乙酸乙酯、乙醇（色谱级）：天津市光复精细化工研究所。

1.1.3 培养基

种子培养基：玉米水解液，pH自然，调节糖度至12°Bx，108℃高压蒸汽灭菌10 min，备用。

发酵培养基：高粱水解液，调糖度至12°Bx，115℃高压蒸汽灭菌20 min，备用。

1.2 仪器与设备

Sever Easy型pH计：瑞士梅特勒托利多仪器有限公司；Agilent 7890B气相色谱仪、1260 Infinity型高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 供氧情况对产酯酵母酒精发酵和产酯的影响

250 mL锥形瓶中分别添加100 mL、150 mL、200 mL、250mL发酵培养基（pH自然（6.7）），酵母接种量5×106CFU/mL。其中装液量100 mL的锥形瓶采用纱布和胶塞（胶塞中央插一9号针头，用于排气）两种封口方式，其余装液量的锥形瓶都采用胶塞封口。在相同的锥形瓶内，装液量的多少反映了供氧的强弱，其中装液量100 mL、纱布封口为供氧最充足的，装液量250 mL、胶塞封口供氧相对最少。发酵温度28℃，根据各种酵母菌发酵速度的不同（卡特多菲毕赤酵母和克鲁斯假丝酵母发酵4 d、汉逊酵母发酵3.5 d、球拟酵母发酵3 d、高产酯酿酒酵母发酵1 d）。发酵完毕测定样品的酒精度、发酵度和乙酸乙酯含量。

1.3.2 发酵pH对产酯酵母酒精发酵和产酯的影响

设置发酵pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、pH自然（6.7），装液量100 mL，纱布封口；其他条件同上。

1.3.3 发酵温度对产酯酵母酒精发酵和产酯的影响

设置发酵温度分别为20℃、24℃、28℃、30℃、32℃、36℃，pH自然（6.7），其他条件同上。

1.3.4 测定方法

（1）酒精度的测定：取100 mL发酵液于蒸馏瓶中，加入100 mL水蒸馏，收集100 mL馏出液，用酒精计法测定[12]。

（2）乙酸乙酯的测定：采用气相色谱外标法检测，色谱柱采用Agilent HP-INNOWAX（30 m×320 μm×0.25 μm），载气为高纯氮气（＞99.999%）；柱流速为0.8 mL/min；进样口温度200℃；检测器温度150℃；程序升温：起始温度50℃，保持8 min，以5℃/min升至150℃，保持15 min；进样体积为1 μL；分流进样，分流比为10∶1[13]。

（3）发酵度：采用高效液相色谱测定发酵前后培养液含糖量[14]，条件为采用HPX-87H（300 mm×7.8 mm×9 μm）的液相色谱柱，二极管阵列检测器（diode array detector，DAD），流动相为0.005 mol/L硫酸溶液，柱温65℃，流速为0.6 mL/min，检测时间23 min，进样量为20 μL。发酵度计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 供氧情况对产酯酵母酒精发酵和产酯的影响

供氧情况对产酯酵母酒精发酵的影响见图1。由图1可知，供氧情况对卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母、球拟酵母的酒精发酵均有显著影响，供氧不足时酵母酒精发酵受抑制，酒精度明显下降。装液量250 mL时卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母、球拟酵母的酒精度分别为有氧发酵（100 mL，纱布）的22.7%、15.3%、27.2%、30.9%，而高产酯酿酒酵母无影响（102.7%）。

供氧情况对产酯酵母发酵度的影响见图2。由图2可知，随着供氧量的减少，产酯酵母的发酵度降低，变化显著。装液量250 mL时卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母、球拟酵母的发酵度分别为26.2%、17.2%、33.5%、30.4%，而高产酯酿酒酵母在各供氧情况下发酵度均保持在94%以上。说明供氧不足的情况下，卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母不能正常发酵。

图2 供氧情况对产酯酵母发酵度的影响Fig.2 Effect of oxygen supply on fermentation degree of ester-producing yeast

图3 供氧情况对产酯酵母产酯的影响Fig.3 Effect of oxygen supply on ester production of ester-producing yeast

供氧情况对产酯酵母产酯的影响见图3。由图3可知，胶塞封口发酵条件下，随着装液量的增加，产酯酵母产酯量下降。装液量100 mL，两种封口方式比较来看，卡特多菲毕赤酵母和克鲁斯假丝酵母胶塞封口下产酯多，汉逊酵母两种方式产酯相当，而球拟酵母和高产酯酿酒酵母纱布产酯高，尤其是球拟酵母。装液量250 mL时卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母、球拟酵母、高产酯酿酒酵母的乙酸乙酯含量分别为有氧发酵（100 mL，纱布）的57.7%、69.4%、68.8%、6.7%、106.3%，说明相对厌氧情况下对球拟酵母产酯的影响最大，对卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母的产酯有显著影响，而高产酯酿酒酵母在厌氧严格时产酯稍有提高。说明供氧情况对各种产酯酵母的影响程度由大到小分别是球拟酵母＞卡特多菲毕赤酵母＞汉逊酵母＞克鲁斯假丝酵母＞高产酯酿酒酵母。

2.2 发酵pH对产酯酵母酒精发酵与产酯的影响

发酵pH对产酯酵母酒精发酵的影响见图4。由图4可知，pH对各种产酯酵母的产酒均有一定影响，其中卡特多菲毕赤酵母的最适pH为5.0，克鲁斯假丝酵母和汉逊酵母最适pH为4.0，球拟酵母最适pH为6.0～7.0，高产酯酿酒酵母在pH4.0～7.0范围内对产酒无明显影响。

图4 发酵pH对产酯酵母酒精发酵的影响Fig.4 Effect of fermentation pH on ethanol fermentation of ester-producing yeast

发酵pH对产酯酵母发酵度的影响见图5。由图5可知，pH对球拟酵母发酵度影响最大，低pH条件下（4.0～5.0）发酵度低，其次是克鲁斯假丝酵母和汉逊酵母，较高pH条件下（6.0～7.0）发酵度稍低，在pH4.0～7.0范围内对卡特多菲毕赤酵母和高产酯酿酒酵母基本无影响。

图5 发酵pH对产酯酵母发酵度的影响Fig.5 Effect of fermentation pH on fermentation degree of ester-producing yeast

发酵pH对产酯酵母产酯的影响见图6。由图6可知，pH对各种产酯酵母的产酯均有一定的影响，其中卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母的最适pH均为6.7，在pH4.0时产酯最差，乙酸乙酯含量分别下降了62.8%、56.2%、46.1%和30.0%；pH对高产酯酿酒酵母的影响相对较小，pH6.0～7.0为pH最适范围，因此发酵pH对产酯酵母产酯影响程度由大到小依次是卡特多菲毕赤酵母＞克鲁斯假丝酵母＞汉逊酵母＞球拟酵母＞高产酯酿酒酵母。

图6 发酵pH对产酯酵母产酯的影响Fig.6 Effect of fermentation pH on ester production of ester-producing yeast

2.3 发酵温度对产酯酵母酒精发酵与产酯的影响

发酵温度对产酯酵母酒精发酵的影响见图7。由图7可知，温度对各种产酯酵母的酒精发酵均有不同程度的影响，其中卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母的最适产酒温度均为28℃，20℃时酒精度最低，相比28℃时酒精度分别下降了29.2%、62.1%、21.9%、71.0%，由此看出，温度对球拟酵母产酒的影响最大，其次是克鲁斯假丝酵母，最后是卡特多菲毕赤酵母和汉逊酵母。温度对高产酯酿酒酵母的影响相对较小，且与上述4种产酯酵母不同，温度较低时产酒稍高。

图7 发酵温度对产酯酵母酒精发酵的影响Fig.7 Effect of fermentation temperature on ethanol fermentation of ester-producing yeast

发酵温度对产酯酵母发酵度的影响见图8。由图8可知，温度对卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母的发酵度均有明显影响，温度低于28℃时发酵速度缓慢，发酵度低，卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母在温度28～36℃范围内发酵正常；温度对高产酯酿酒酵母的影响相对较小，温度在20～36℃范围内发酵均正常。

图8 发酵温度对产酯酵母发酵度的影响Fig.8 Effect of fermentation temperature on fermentation degree of ester-producing yeast

发酵温度对产酯酵母产酯的影响见图9。由图9可知，温度对各种产酯酵母产酯的影响较大，其中卡特多菲毕赤酵母的最适温度为20℃，克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和高产酯酿酒酵母的最适温度为24℃，球拟酵母的最适温度为28℃。球拟酵母在20℃时产酯最差，相比28℃时产酯量下降了72.2%；其他4种酵母均在36℃时产酯最差，相比各酵母最适温度条件下的产酯量分别下降91.3%、89.6%、90.3%、54.7%。从而得出温度对各种产酯酵母产酯影响的大小依次为：卡特多菲毕赤酵母＞汉逊酵母＞克鲁斯假丝酵母＞球拟酵母＞高产酯酿酒酵母。

图9 发酵温度对产酯酵母产酯的影响Fig.9 Effect of fermentation temperature on ester production of ester-producing yeast

3 结论

供氧情况、发酵pH和温度对白酒生产常用产酯酵母菌（卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母）的酒精发酵和产酯有明显影响，其中供氧不足时对酒精发酵和产酯的影响最大，pH低、温度高时产酯下降明显。除高温对产酯有一定影响外，在本实验所选发酵条件范围内高产酯酿酒酵母的酒精发酵和产酯无明显变化，说明高产酯酿酒酵母具有广泛的适应性。

众所周知，白酒发酵过程是在厌氧和低pH环境下进行的，卡特多菲毕赤酵母、克鲁斯假丝酵母、汉逊酵母和球拟酵母等白酒生产中常用的产酯酵母直接入池发酵对白酒增酯效果不明显。如果将这些酵母在池外单独培养，在适合酵母的产酯条件下制备成酯化液或固态香醅，然后再入池发酵或与池内酒醅混蒸，即可有效提高成品酒中的酯含量。对于小曲白酒、芝麻香型白酒、酱香型白酒，由于其生产工艺中有堆积培菌过程环节，而此过程是有氧的，如果在堆积培菌前接入这些产酯酵母与传统糖化发酵剂协同糖化发酵，同样可明显提高酯含量。高产酯酿酒酵母由于具有广泛的适应性，其应用方式不受限制，既可池外培养后入池发酵，也可直接入池发酵。此外，各种产酯酵母的最适产酯温度都在28℃以内，温度高时产酯能力明显下降。

[1]杨 强，唐 洁，杨生智，等.清香型小曲白酒产酯酵母的筛选及应用[J].酿酒科技，2016，11（1）：78-80.

[2]张会娟，张首玉，邱 聪，等.一株产酯酵母的鉴定及发酵性能研究[J].河南工业大学学报：自然科学版，2015，36（2）：23-27.

[3]ERIKSEN D T,HAMEDIRAD M,YUAN Y,et al.Orthogonal fatty acid biosynthetic pathway improves fatty acid ethyl ester production inSaccharomyces cerevisiae[J].Acs Syn Biol,2015,4(7):808-814.

[4]徐丽萍.泸型大曲中产酯酵母的筛选鉴定及产酯条件优化[J].中国酿造，2016，35（2）：74-78.

[5]ZHUANG S,FU J,POWELL C,et al.Production of medium-chain volatile flavour esters inPichia pastoris,whole-cell biocatalysts with extracellular expression ofSaccharomyces cerevisiae,acyl-CoA:ethanol O-acyltransferase Eht1 or Eeb1[J].Springerplus,2015,4(1):1-9.

[6]肖冬光，赵树欣，陈叶福.白酒生产技术[M].北京：化学工业出版社，2011：23-26.

[7]张宏伟，耿丽欣.应用产酯酵母提高白酒质量的试验[J].酿酒，1991，17（5）：26-27.

[8]宋玉华，吴 鸣.产酯酵母在凌塔白酒工艺上的应用[J].酿酒，1991，17（4）：31-33.

[9]刘桂君，尚宏忠，李艳敏，等.红曲与酵母共培养对红曲菌产酯的影响[J].酿酒科技，2011（10）：57-60.

[10]李锐利.高产乙酸乙酯酵母的选育及在清香型小曲酒中的应用研究[D].武汉：湖北工业大学，2011.

[11]王瑞明，汤克霞，马美荣，等.异汉逊酵母呼吸缺陷型产酯代谢规律的探讨[J].齐鲁工业大学学报：自然科学版，1997，11（2）：52-55.

[12]陆 武.酒精计法和密度瓶法测量酒精度的讨论[J].工程技术：文摘版，2016，12（12）：81.

[13]王沙木.气相色谱法测定白酒中乙酸乙酯含量的探讨[J].黑龙江科技信息，2007，2（1X）：30-30.

[14]马 瑞，欧阳嘉，李 鑫，等.高效液相色谱法同时测定生物质乳酸发酵液中有机酸及糖类化合物[J].色谱，2012，30（1）：62-63.

[15]ROJAS V,GIL J V,PIÑAGA F,et al.Studies on acetate ester production by non-Saccharomyces,wine yeasts[J].Int J Food Microbiol,2001,70(3):283-289.

[16]吴桂珍，李秀英，马金杰.产酯酵母的性能研究[J].高师理科学刊，2000，1（1）：57-59.

[17]CHEN M,LI R,PENG N,et al.Screening of higher yield of ethyl acetate yeast and researching of ester-producing conditions[J].African J Microbiol Res,2011,5(12):1383-1388.

[18]孙神英.不同酵母菌对白酒风味成分的影响[D].武汉：武汉轻工大学，2014.

[19]黄光建，徐学锋，郭梅君，等.豉香型白酒酒饼中高产乙酸乙酯酵母菌的分离鉴定及发酵性能研究[J].食品工业科技，2015，36（11）：153-158.

[20]HOUTMAN A C,MARAIS J,PLESSIS C D.The possibilities of applying present day knowledge of wine aroma components：Influence of several juice factors on fermentation rate and ester production during fermentation[J].S Afr J Enol Vitic,2017,1(1):27-33

[21]牛广杰.优良产酯酵母菌的筛选及发酵性能研究[J].酿酒，2013，40（6）：56-59.

[22]GOBBI M,DE V L,SOLIERI L,et al.Fermentative aptitude of non-Saccharomyceswine yeast for reduction in the ethanol content in wine[J].Eur Food Res Technol,2014,239(1):41-48.

[23]钟姝霞，万世旅，边名鸿，等.一株高产乙酸乙酯酵母的鉴定及产酯条件的研究[J].中国酿造，2017，36（2）：75-79.