毛霉40899和毛霉M/T混合发酵腐乳的研究

胡永金 任淑娣 王知荣 柴建国 许佳威

中图分类号：TS214.2文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.2096-1553.2019.01.001

文章编号：2096-1553（2019）01-0001-10

关键词：腐乳;毛霉;混合菌种发酵;蛋白酶活力

摘要：从腐乳毛坯中分离得到毛霉M/T，以毛霉40899和毛霉M/T为混合发酵剂，采用单因素法和响应面法研究混合菌种发酵腐乳的前发酵工艺，并在最优前发酵条件下考察混合菌种发酵过程中腐乳的氨基酸态氮、質构特性和色度的变化，得出如下结果：经鉴定，毛霉M/T为放射毛霉属;腐乳前发酵最优条件为发酵时间60 h，毛霉40899与毛霉M/T质量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5.在此条件下，腐乳的蛋白酶活力达到最大值48.015 U/mL.腐乳后发酵至30 d时，腐乳中氨基酸态氮含量为0.53 g/（100 g），达到腐乳行业标准中的成熟标准.腐乳成熟时的硬度、黏附性、弹性等质构特性良好，色差值与市售成熟腐乳接近.

0 引言

腐乳是我国传统的大豆发酵制品，它以大豆为基本原料，利用多种微生物对其进行协同发酵而制成，风味独特，质地鲜美，营养丰富[1-3]，因而受到全球消费者的喜爱.目前我国的腐乳生产仍以传统工艺为主，由于不同的菌种在发酵过程中所分泌的酶系不同，现腐乳的发酵生产存在周期长、受季节限制、效率低、产品品质和风味稳定性难以控制等问题.

腐乳的发酵是微生物及其所产生的酶系不断作用的过程，核心工艺是蛋白酶系将蛋白质分解成多肽、氨基酸等小分子化合物，以及风味物质的形成[4-8].为了缩短生产周期，提高产品质量，筛选出高产且蛋白酶系齐全的发酵菌株是腐乳生产工艺的关键.赵玉莲等[9]从各地腐乳样品中分离出一些微生物，并对产酶情况进行相关研究发现，不同厂家所选用的菌种不同，产酶类别和含量不同，所需培养周期也不同.M.Frans等[10]研究了食盐对腐乳中蛋白质和脂肪水解的影响发现，低盐条件（质量分数8%）下腐乳成熟时间缩短至40 d.B.Z.Han等[11]利用少孢根霉发酵腐乳，显著改善了产品风味.目前我国工业生产多采用纯菌种发酵腐乳，然而单一菌种发酵存在酶系不全，风味单调等问题[12， 13].鉴于此，本研究拟对毛霉40899和毛霉M/T混合发酵腐乳的前发酵工艺进行优化，并对后发酵过程中氨基酸态氮、质构特性及色度进行测定，以期为品质优良的腐乳发酵剂的开发提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 实验材料

食品原料：新鲜豆腐、润丰油腐乳、食盐、白酒、辣椒粉、花椒粉、胡椒粉、植物油，均购自昆明沃尔玛超市.

实验试剂：乳酸酚棉兰染液、福林酚，索莱宝生物科技有限公司产;干酪素、酚酞、碳酸钠、氢氧化钠、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钠，天津市风船化学试剂科技有限公司产;乳酸、三氯乙酸，广东光华科技股份有限公司产;甲醛溶液，成都市科隆化学品有限公司产.以上试剂均为分析纯.马铃薯葡萄糖琼脂培养基（生化试剂BR），青岛高科园海博生物科技有限公司产.

菌种：毛霉40899，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心;菌株M/T，分离自天和腐乳毛坯，云南农业大学食品科技学院实验室保存.

1.1.2 实验设备

HWS24型恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司产;T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司产;BSC-250恒温培养箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂产;PHS-3CpH计，仪电科学仪器有限公司产;LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安有限公司产;TA.XT Plus质构仪，超技仪器有限公司产;EX30光学显微镜，宁波舜宇仪器有限公司产;H2-16KR台式高速冷冻离心机，湖南可成仪器设备有限公司产;CR-400型色差计，日本柯尼卡美能达公司产;SHA-BA恒温振荡器，常州澳华仪器有限公司产;热板IT-09A5磁搅拌器，上海一恒科技有限公司产;SW-CJ-2D双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司产.

1.2 实验方法

1.2.1 菌株M/T的鉴定

采用选择性培养基（察氏培养基）从天和腐乳毛坯分离得到优势菌株M/T，并将该菌株点种于PDA培养基上，于28 ℃下培养2 d后进行形态学和生理生化鉴定.

1.2.2 发酵工艺流程

前期发酵：新鲜豆腐→切块（3 cm×3 cm×1.5 cm）→紫外灯杀菌30 min→蘸浸菌悬液→喷洒乳酸→温度28 ℃，湿度96%条件下发酵→毛坯.

后期发酵：毛坯→搓毛→腌坯→配料→装瓶→灌油→后酵→成熟.

1.2.3 混合菌种发酵腐乳前发酵条件的单因素试验

1）发酵时间对混合菌种发酵腐乳的影响试验.

基于预实验结果，设置发酵温度28 ℃，湿度96%，菌悬液浓度1.0×107 CFU/mL，毛霉40899与菌株M/T质量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5，测定不同时间段（24 h，36 h，48 h，60 h，72 h）混合菌种发酵腐乳毛坯的蛋白酶活力.

2）毛霉40899与菌株M/T质量比对混合菌种发酵腐乳的影响试验.

设置发酵温度28 ℃，湿度96%，菌悬液浓度1.0×107 CFU/mL，乳酸pH值3.5，发酵时间60 h，测定毛霉40899与菌株M/T不同质量比（1GA6FA3，1GA6FA2，1GA6FA1，2GA6FA1，3GA6FA1）的混合菌种发酵腐乳毛坯的蛋白酶活力.

3）乳酸pH值对混合菌种发酵腐乳的影响试验.

设置发酵温度28 ℃，湿度96%，菌悬液浓度1.0×107 CFU/mL，发酵时间 60 h，毛霉40899与菌株M/T质量比1GA6FA1，测定不同乳酸pH值（2.0，2.5，3.0，3.5，4.0）混合菌种发酵腐乳毛坯的蛋白酶活力.

1.2.4 响应面法优化混合菌种发酵腐乳的前发酵条件

利用响应曲面Box＼|Behnken试验设计，以蛋白酶活力为反映指标，选取发酵时间、毛霉40899与菌株M/T质量比、乳酸pH值 3个影响显著的因素，进行3因素3水平的试验设计[14-15].

1.2.5 测定方法

菌悬液浓度的测定采用血球计数板法[16];蛋白酶活力测定采用福林酚法[17];氨基酸态氮含量按照腐乳行业标准SB/T 10170—2007进行测定[18];采用质构仪位移模式，用两种探头对腐乳的质地剖面进行质构特性分析与测定[19];以市售的润丰油腐乳为对照样，采用CR-400型色差计的L*a*b*测量系统对色度进行测定[20].

1.3 数据处理

采用Excel，Design Expert8.0，Origin9.0分析处理.

2 结果与分析

2.1 菌株M/T的鉴定结果

通过乳酸石碳酸棉蓝染色实验，显微镜下菌株M/T的形态如图1所示.

由图1可知，菌株M/T的菌丝无横隔，孢子囊顶生，球形，孢囊梗直立分支多集中于顶端，无假根.包囊孢子大多数呈圆形，少数呈椭圆形.此外，该菌株的最适生长温度为28 ℃，对数生长期为6～36 h，对葡萄糖的利用率高于对果糖、乳糖、蔗糖、半乳糖的利用率，对淀粉利用率最差.根据以上实验结果可初步判断菌株M/T为毛霉科（Mucoraceae），放射毛霉属（Actinomucor）[21].

2.2 腐乳前发酵条件的单因素试验结果

2.2.1 发酵时间对混合菌种发酵腐乳蛋白酶活力的影响 在毛霉40899与菌株M/T质量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5条件下，

不同发酵时间对混合菌种发酵腐乳蛋白酶活力的影响如图2所示.由图2可知，随着发酵时间的延长，蛋白酶活力呈现先增加后减少的趋势.在发酵的第60 h，蛋白酶活力达到最大值34.371 U/mL.这是由于从发酵初期到发酵60 h这一阶段，腐乳毛坯上的霉菌不断生长代谢繁殖，霉菌菌丝也不断生长，菌丝群的代谢率处于旺盛期，因而蛋白酶活力不断增长;随着发酵时间的进一步延长，腐乳毛坯表面的菌丝开始变黑变黄，出现孢子，霉菌菌丝开始老化.因此，选择60 h为适宜的发酵时间.

2.2.2 毛霉40899與毛霉M/T质量比对混合菌种发酵腐乳蛋白酶活力的影响

在发酵时间60 h，乳酸pH值3.5条件下，毛霉40899与毛霉M/T不同质量比对混合菌种发酵腐乳蛋白酶活力的影响如图3所示.由图3可知，随着毛霉40899在混合菌种中的占比不断增加，蛋白酶活力也越来越高，在菌种配比为1GA6FA1时达到最大值，接近30 U/mL.两者的混合可能使菌种之间取长补短，促进蛋白酶活力的增加.而当毛霉40899在混合菌种中的占比继续增大时，蛋白酶活力则开始下降.因此，毛霉40899与毛霉M/T质量比选择1GA6FA1较适宜.

2.2.3 乳酸pH值对混合菌种发酵腐乳蛋白酶活力的影响 在发酵时间60 h，毛霉40899与毛霉M/T质量比1GA6FA1条件下，

不同的乳酸pH值对混合菌种发酵腐乳蛋白酶活力的影响如图4所示.由图4可知，当pH值不断升高时，分泌蛋白酶的活力呈现先递增后减少的趋势.当pH为3.5时，蛋白酶活力达到最大，接近 28 U/mL.原因可能是随着乳酸pH值的增大，酸度逐渐下降，霉菌的生长繁殖速度不断加快，且适当的pH值能够有效抑制杂菌生长，蛋白酶活力也不断增强.而当pH值继续增加时，蛋白酶活力不断减少，这可能是由于酸度不断降低，乳酸对杂菌的抑制力也相应降低.因此，乳酸pH值选择3.5为宜.

2.3 响应面法优化混合菌种发酵腐乳前发酵条件试验结果

2.3.1 响应面试验设计与结果

以单因素试验结果为基础，以蛋白酶活力为指标，选取发酵时间（A）、毛霉40899与毛霉M/T质量比（B）和乳酸pH值（C）3个因素，使用Design＼|Expert 8.0软件进行响应面试验设计.因素与水平表和试验结果分别见表1和表2.

利用Design＼|Expert8.0软件对数据进行拟合分析，以蛋白酶活力为因变量（Y），以发酵时间（A）、毛霉40899与毛霉M/T质量比（B）和乳酸pH值（C）为自变量，得到的回归方程为

Y=48.34+0.51A-0.77B+0.48C+0.78AB+0.36AC+0.41BC-9.70A2-3.94B2-4.49C2

偏回归系数方差分析结果见表3.

由表3可知，所选择的模型其不同处理间差异具有高度显著性（P<0.000 1），即用回归方程来体现各个变量因子与响应值之间的关系，其自变量与因变量之间的线性关系显著，说明该试验方法可信.失拟项0.226 5>0.05，表明回归方程的试验拟合较好，试验过程中出现的误差较小.校正系数R2Adj=0.994 1，即该模型能解释99%的响应值变化.通过F值可以看出各个因素在试验中对协同发酵腐乳前发酵产蛋白酶效果的影响大小顺序为：毛霉40899与毛霉M/T质量比>发酵时间>乳酸pH值.

2.3.2 双因子效应分析结果

基于回归方程和回归模型方差分析表得到的各因素交互作用的响应面变化三维曲面图和等高线如图5所示.由图5可知，前发酵过程中，当乳酸pH值固定时，随着发酵时间和毛霉40899与毛霉M/T质量比的递增，蛋白酶活力呈现先上升后下降的趋势.由两因素交互作用的3D图是凸型且等高线呈椭圆形可知，两因素之间交互作用较强.当毛霉40899与毛霉M/T质量比固定时，随着发酵时间和乳酸pH值的递增，蛋白酶活力呈现先上升后下降的趋势;当发酵时间固定时，随着乳酸pH值和毛霉40899与毛霉M/T质量比的递增，蛋白酶活力呈现先上升后下降的趋势.图5b）和c）的等高线为圆形，说明发酵时间与乳酸pH值、毛霉40899与毛霉M/T质量比和乳酸pH值之间的交互作用不显著，与回归模型方差分析表反映的结果一致.综上，由此回归模型得出前发酵较优条件为发酵时间60.28 h，毛霉40899与毛霉M/T质量比1GA6FA1.18，乳酸pH值3.53，该条件下腐乳的蛋白酶活力响应曲面出现最高点，其预测值为48.38 U/mL.

2.3.3 最佳前发酵条件的确定与验证

为了验证模型的有效性，考虑到实际情况，将较优条件修改为发酵时间60 h，毛霉40899与毛霉M/T质量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5，与单因素试验结果大致吻合.利用此发酵条件进行3次腐乳前发酵实验，测得蛋白酶活力的平均值为48.015 U/mL，与预测值接近，说明此模型能较好地预测腐乳的蛋白酶活力.

2.4 腐乳发酵过程中游离氨基酸态氮的变化规律

图6为腐乳发酵过程中氨基酸态氮含量的变化情况.由图6可知，腐乳在发酵过程中氨基酸态氮含量呈上升趋势.前发酵过程中由于霉菌生长繁殖分泌蛋白酶，氨基酸氮含量出现小幅上升;腌制阶段由于高浓度食盐有抑制酶活力的作用，游离氨基酸态氮上升不明显;进入后发酵后，腐乳中游离氨基酸氮含量快速上升然后趋于平缓.腐乳中的游离氨基酸是蛋白质降解的最终产物，腐乳的滋味与其含量密切相关，行业标准规定每100 g腐乳中氨基酸态氮含量不低于0.42 g，即达到基本成熟.由图6可知，腐乳在后发酵30 d时达到基本成熟标准，此时每100 g腐乳中氨基酸态氮含量为0.53 g，与多数报道中单菌发酵40～50 d腐乳才基本成熟相比，周期大大缩短，说明混合菌种发酵有利于缩短腐乳的发酵周期.

2.5 腐乳发酵过程中质构特性的变化规律

2.5.1 腐乳发酵过程中硬度的变化

图7为腐乳发酵过程中硬度的变化情况.由图7可知，腐乳后发酵30 d腐乳坯的硬度比白坯下降了31.97%.在发酵的过程中，前酵阶段由于霉菌菌丝的包裹，腐乳毛坯的硬度增大;腌制过程中，由于食盐的加入导致水分析出，腐乳的硬度直线上升;进入后发酵时段，腐乳的硬度与腐乳各成分含量存在一定的相关性，与腐乳降解程度相关，蛋白质降解造成腐乳坯体变柔软，并且后发酵过程中植物油的浸泡与渗透也促使坯体硬度迅速减小.

2.5.2 腐乳发酵过程中弹性的变化

图8为腐乳发酵过程中弹性的变化情况.由图8可知，在腐乳发酵过程中，弹性变化呈现逐渐减小趋势.前发酵阶段，毛坯外部被菌丝紧密包裹，硬度有所增加，弹性减小但幅度不大;腌坯阶段，弹性减小是由于高盐浓度使盐坯硬度增加，导致弹性降低;后发酵阶段，由于大分子物质在各种酶系的催化作用下逐渐降解为小分子物质，使得腐乳坯逐渐变得松软，弹性逐渐减小，后发酵30 d时，腐乳坯的弹性较白坯下降了72.11%.

2.5.3 腐乳发酵过程中黏附性的变化

图9为腐乳发酵过程中黏附性的变化情况.腐乳的黏附性与大豆蛋白的凝膠结构密切相关，腐乳发酵过程中，随着蛋白质的降解，凝胶结构被破坏，使得腐乳越来越软，从而黏附性越来越大.

由图 9可知，腐乳后发酵30 d腐乳坯的胶黏性比白坯增加了74.07%.前发酵和腌制阶段由于酶系的作用不明显，黏附性的变化不显著;进入后发酵阶段，酶系作用增强，使得腐乳的黏附性显著增大，随着后发酵的进行，蛋白质降解速率减缓，腐乳黏附性的变化也逐渐趋于平缓.

2.6 腐乳发酵过程中的色度变化

表4为腐乳发酵过程中的色度变化情况.由表4可以看出，腐乳的明度随着发酵时间延长而不断降低，在前发酵过程中，由于毛坯外裹一层带有少许孢子的菌丝，因而明度降低;在后发酵过程中，明度进一步降低，这是因为随着发酵时间的延长和蛋白质脂肪的酶解，微观结构粒度变弱，对于光的反射变弱，导致腐乳明度降低[20].此外，明度的降低还与加入调味料有关.腐乳的黄度随着发酵时间延长而不断升高，在前发酵中，黄度升高的主要原因在于大豆异黄酮类物质在微生物分泌的氧化酶作用下生成羟基化合物，该化合物呈黄色，所以毛坯变黄.腐乳的红度随着发酵时间延长逐渐升高，在前发酵阶段小幅升高，后发酵阶段大幅升高，这是因为后发酵时盐坯裹上了辣椒粉调料，随着浸泡时间的延长，红度逐渐升高.后发酵30 d的腐乳其色差值较为接近市售润丰油腐乳，表明腐乳表观品质良好.

3 结论

本文从腐乳毛坯中分离得到毛霉M/T，以蛋白酶活力为指标，通过单因素试验和响应面试验优化毛霉40899和毛霉M/T混合发酵腐乳的前发酵工艺，并在最优前发酵条件下考察混合菌种发酵腐乳过程中氨基酸态氮、质构特性和色度的变化规律.混合菌种发酵腐乳的最佳前发酵条件为：发酵时间60 h，毛霉40899与毛霉M/T质量比1GA6FA1，乳酸pH值3.5.在此条件下前发酵的腐乳经后发酵30 d后，每100 g腐乳中氨基酸态氮含量为0.53 g，达到腐乳行业标准中基本成熟的规定，且腐乳硬度、黏附性、弹性和色度指标良好.因此，毛霉40899和毛霉M/T混合发酵不仅能提高腐乳发酵优势菌株的丰富度，且在不影响腐乳品质指标的前提下缩短发酵周期.

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