响应面法优化刺梨果醋的发酵条件

李小红，阳如诗，魏韶，张小松，吴德智

(贵州理工学院，贵阳 550003)

刺梨(RosaroxbunghiiTratt)是蔷薇科多年生落叶丛生灌木缫丝花的果实，果实多为扁球形浆果，成熟时为黄棕色[1]，是集保健、药用及食用为一体的绿色水果[2]，具有独特的芳香味，营养丰富，含有很多生物活性物质，包括具有抗氧化作用的黄酮、类黄酮、VC、VP(芦丁)等，有“三王水果”之称[3]。但是刺梨果汁含有大量的单宁等多酚物质[4]，具有较强的苦涩味[5]，因此直接食用会影响口感。

以水果或果品加工下脚料为主要原料，以酒精发酵及醋酸发酵酿制而得到的营养丰富、风味独特的调吴德智(1983-)，男，副教授，博士，研究方向：食品药品研究与开发。

味品定义为果醋。果醋既有水果和食醋的营养保健功效，又是具有营养、保健及食疗等功能为一体的新型调味品[6,7]。刺梨酿制成果醋，不仅可以解决刺梨口感问题，同时还保留了刺梨原有的营养物质，并且发酵之后的产品吸收更好，增加刺梨的附加值[8-10]。

单因素试验分别对刺梨果醋醋酸发酵过程的接种量、发酵温度、发酵时间及装液量4个因素的最佳工艺参数进行探讨，然后通过响应曲面法对以上4个因素进行优化，获得刺梨果醋发酵的最佳工艺条件，为刺梨果醋工厂化生产提供理论依据，为刺梨深加工产品的不断开发利用提供新途径。

1 材料与方法

1.1 菌种、试剂

果酒酵母1969、醋酸杆菌20056：中国发酵工业研究所(CICC)；刺梨：本地人工种植，充分成熟，新鲜无霉烂变质；酵母浸粉、葡萄糖、琼脂：天津市华东试剂厂；其他试剂：均为分析纯。

1.2 仪器及设备

DK-98-1型电热恒温水浴锅 上海上天精密仪器有限公司；UV-2550型紫外-可见分光光度计 梅特勒-托利多国际股份有限公司； FA1004B型电子天平 上海越平科学仪器有限公司；九阳 JYZ-E6型榨汁机 九阳股份有限公司；J0050024型生化培养箱 上海福玛试验设备有限公司；WF32型精密色差仪 深圳威孚光电科技有限公司；PX-A1T型酒精浓度计 广州市普析通用仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 刺梨果醋制作工艺流程[11]

1.3.2 操作过程

1.3.2.1 原料清洗

通过流动水漂洗挑选出成熟、饱满、无虫害及无霉烂变质的刺梨。

1.3.2.2 破碎、酶解

将清洗处理好的刺梨果实打浆，为了提高出汁率，酶解时添加果胶酶55 mg/L，在50 ℃保温酶解3.0 h。

1.3.2.3 调整成分

为了充分满足酵母发酵的需求，加白砂糖将糖度调整为17%。

1.3.2.4 灭酶及灭菌

高温可以使酶失效，因此在成分调整后通过升高温度达到灭酶及灭菌的目的，在90 ℃保温20 min。

1.3.2.5 酒精发酵

在刺梨果汁中按照果汁量3%接种加入果酒酵母1969，在30 ℃，发酵5天左右。

1.3.3 刺梨醋酸发酵条件优化

1.3.3.1 单因素试验

本试验针对原料装液量、发酵温度、发酵时间及醋酸菌接种量4个因素，保持其中3个因素固定不变，进行单因素试验，以多酚和黄酮为次要指标，醋酸产量为主要指标，确定混料设计所需的水平。

1.3.3.2 响应面试验设计

以醋酸产量为主要指标，经过对刺梨果醋配方的单因素试验，选择混料优选范围：醋酸菌接种量(A)(10%，12%，14%)、发酵时间(B)(9，10，11 天)、发酵温度(C)(30，32，34 ℃)、装液量(D)(8%，12%，16%)。采用Design-Expert 8.0.6软件进行混料设计，并以醋酸含量为指标，从而选出最佳配方，试验设计见表1。

表1 Box-Benhnken响应面试验因子与水平表Table 1 The factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.3.4 指标测定及方法

1.3.4.1 基础指标测定

醋酸产量测定，参考王颖等的方法[12]；色度值采用精密色差仪；酒精度采用酒度计。

1.3.4.2 总多酚的测定

采用福林酚法进行测定[13]。刺梨果醋适当稀释，吸取1 mL，加入0.2 mL福林酚试剂，摇匀，放置3 min 后加入1 mL 10% Na2CO3溶液，充分混合后室温下静置1 h，于760 nm波长处测定吸光度。以没食子酸为标样，制作标准曲线，得出总酚含量Y与吸光度X的标准方程： Y=0.4417X+0.0012，R2=0.9931，在1.0～15.0 mg/L浓度范围内有良好的线性关系。

1.3.4.3 总黄酮的测定

本试验采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定总黄酮的含量。参考白立敏等的方法[14]，精密称取芦丁标准品，40%乙醇配制得130.0 mg/L的芦丁储备液。准确移取储备液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL置于10 mL容量瓶中，加入40%乙醇4.0 mL，静置5 min后加入5% NaNO3溶液0.5 mL，摇匀，静置5 min后加入0.5 mL 的10% Al (NO3)3溶液，摇匀，静置5 min，最后加入3 mL 4% NaOH溶液，以乙醇为溶剂定容至10 mL。充分摇匀，静置15 min后，于510 nm下测定吸光度，同时以空白试剂作参比。以吸光度Y为纵坐标与浓度X为横坐标(mg/L)，得标准回归方程Y=0.1124X-0.0012，R2=0.9993。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 醋酸菌接种量对刺梨果醋醋酸发酵的影响

取刺梨酒精发酵后的样品100 mL置于250 mL圆底烧瓶中，分别加入6%，8%，10%，12%，14%的醋酸菌接种量，在30 ℃的环境中静置发酵8天，然后测定果醋中的醋酸含量，结果见表2。

表2 醋酸菌接种量对果醋的影响Table 2 The single factor experimental results of acetic acid bacteria inoculation amount

随着接种量的升高，果醋中的醋酸含量先逐渐升高后趋于平衡。多酚、黄酮含量逐渐降低，且多酚减少幅度最大。当醋酸菌接种量为12%时，醋酸含量最高，为4.76 g/dL。在营养物质一定的条件下，接种量过大时，发酵液内醋酸菌的含量增大，导致消耗的营养也随之增多，但是同时用于生成醋酸的底物又不变，从而导致醋酸产量相对降低[15]。

2.1.2 发酵时间对刺梨果醋醋酸发酵的影响

取刺梨酒精发酵后的样品100 mL置于250 mL圆底烧瓶中，接种醋酸菌量为12%，装液量为12%，在30 ℃下分别静置发酵 7，8，9，10，11 天，测定果醋中的醋酸，结果见表 3 。

表3 发酵时间对果醋的影响Table 3 The single factor experimental results of fermentation time

随着发酵时间的延长，果醋中的醋酸含量逐渐升高而后趋于平衡，在发酵第 11天时醋酸含量略有降低。当发酵时间为10天时，醋酸含量最高。此外，随着发酵时间的延长，多酚、黄酮含量逐渐降低，且多酚减少幅度最大。在营养物质一定的条件下，发酵时间延长，发酵液内醋酸菌含量不断增多，其消耗的营养也越多，同时用于生成醋酸的底物较少，从而使得产酸量也相对较低。

2.1.3 发酵温度对刺梨果醋醋酸发酵的影响

取刺梨酒精发酵后的样品100 mL置于250 mL圆底烧瓶中，接种醋酸菌量为12%，装液量为12%，分别在 26，28，30，32，34 ℃下静置发酵10 天，测定果醋中的醋酸，结果见表 4。

表4 发酵温度对果醋的影响Table 4 The single factor experimental results of fermentation temperature

随着发酵温度的升高，果醋中的多酚及黄酮含量均下降，这是因为温度升高营养物质分解速度加快导致。醋酸含量先升高后降低，当发酵温度为 32 ℃时，醋酸含量最高，为4.86 g/dL。这是因为当发酵温度过低时，醋酸菌的生长代谢比较缓慢，醋酸产量低，随着温度的升高生长代谢加快，醋酸含量随之增加，但是当温度过高时又会导致菌体老化，代谢性能降低。

2.1.4 装液量对刺梨果醋醋酸发酵的影响

取刺梨酒精发酵后的样品在装液量为8%，12%，16%，20%，24%分别置于250 mL圆底烧瓶中，接种醋酸菌量为12%，32 ℃下静置发酵10天，测定果醋中的醋酸，结果见表5 。

表5 装液量对果醋的影响Table 5 The single factor experimental results of the volume of liquid

随着装液量的升高，果醋中的醋酸含量先升高后逐渐降低且降低效果明显，这是因为醋酸菌是好氧菌，装液量越多与空气的接触面积就越小，醋酸菌生成代谢得不到足够的氧气使醋酸发酵缓慢，醋酸产量反而减少。当装液量为12%时，醋酸含量最高，为4.98 g/dL。此外，随着发酵液装液量的升高，多酚、黄酮含量逐渐升高。这是因为装液量较少时，溶解氧过高会导致还原性物质多酚、黄酮的降解。

2.2 刺梨果醋发酵工艺条件的响应面优化

在单因素试验的基础上，选取接种量(10%，12%，14%)、发酵时间(9，10，11天)、发酵温度(30，32，34 ℃)及装液量(8%，12%，16%)4个对刺梨果醋发酵有较大影响的因素，采用Design-Expert 8.0.6提供的Box-Benhnken试验，以刺梨果醋的量为指标优化发酵工艺条件，试验设计见表6。

表6 响应面试验设计及结果Table 6 The design and results of response surface analysis

续 表

2.3 Box-Benhnken响应曲面设计优化复合发酵果浆的发酵条件

采用Design-Expert 8.0.6 提供的Box-Benhnken试验，对各因素进行拟合，得到多元回归方程：R=4.95-0.013A+0.082B+0.023C-0.079D-0.055AB+0.005AC+0.037AD+0.005BC-0.048BD-0.0075CD-0.15A2-0.30B2-0.26C2-0.36D2。

对刺梨果醋醋酸含量的回归模型进行方差及显著性分析，结果见表7。

表7 感官评分回归方程的方差与显著性分析Table 7 Variance and significant analysis of regression equation of sensory scores

续 表

该模型方程有显著性影响(P<0.0001)，失拟项不显著(P=0.0612>0.05)，说明在本试验条件下，该回归模型所考察的因素足以反映试验中发酵条件对刺梨果醋含量的影响。判定系数R2=0.9832，Radj2=0.9671，说明回归模型与实验值拟合较好，可用于刺梨果醋含量的理论推测和分析，各因素影响大小依次为：发酵时间>装液量>发酵温度>接种量。由F检验可知，一次项中发酵时间、装液量对刺梨果醋的产量具有极显著影响(P<0.01)；在二次项中接种量、发酵时间、发酵温度以及装液量对刺梨果醋的产量具有极显著影响(P<0.01)；其他因素之间不显著(P>0.05)。与图1中3D效应面图反映出的各因素间的交互作用相吻合。

图1 各因素交互的3D响应面图谱Fig.1 3D response surface of different interaction factors

由Design-Expert 8.0.6软件得出刺梨果醋醋酸的最佳发酵工艺参数是接种量为11.65%，发酵时间为10.13天，发酵温度为32.08 ℃，装液量为11.58%，刺梨果醋醋酸含量为4.96 g/dL，为了便于生产，我们将接种量定为11.7 %、发酵时间定为10天、发酵温度定为 32 ℃、装液量定为11.6%。进一步验证试验，得出刺梨果醋醋酸含量为4.98 g/dL。该值与预测值比较近，因此选取此为刺梨果醋醋酸的发酵工艺参数。

3 结论

通过单因素和 Box-Benhnken响应面试验，利用统计学的方法建立了刺梨果醋发酵条件的二次多项式模型：R=4.95-0.013A+0.082B+0.023C-0.079D-0.055AB+0.005AC+0.037AD+0.005BC-0.048BD-0.0075CD-0.15A2-0.30B2-0.26C2-0.36D2。

由Design-Expert 8.0.6软件得出刺梨果醋醋酸的最佳发酵工艺参数是接种量为11.65%，发酵时间为10.13天，发酵温度为32.08 ℃，装液量为11.58%，刺梨果醋醋酸含量为4.96 g/dL，为了便于生产，我们将接种量定为11.7%、发酵时间定为10天、发酵温度定为32℃、装液量定为11.6%。与进一步验证试验数据基本吻合，也就是本试验范围内建立的模型准确有效，可用来预测刺梨果醋发酵工艺参数。得到的果醋醋香浓郁，味酸醇厚，营养成分丰富，具有很好的开发前景。

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