FGFR3在膀胱癌发生及靶向治疗中作用的研究进展

陈印，顾鹏，李秋艳，李显永，柯坤彬

(1昆明医科大学第一附属医院，昆明650032；2昆明医科大学)

膀胱癌是常见的恶性肿瘤之一，在全世界癌症发病率中排第7位，男女发病比例3.5∶1，发病高峰年龄50～70岁。尽管目前有多种治疗方法，但有50%～70%的表浅性膀胱癌会复发，10%～20%的表浅性膀胱癌会进展为浸润性膀胱癌。一旦发展为肌层浸润性膀胱癌，患者生存时间会大大缩短，5年生存率低于50%。由于其复发率高，治疗时间长，成为花费最 高的肿瘤之一。2010年美国膀胱癌花费40亿美元，估计2020年会达50亿美元。虽然转移性膀胱癌患者采用以吉西他滨+顺铂为一线的全身化疗应用越来越广泛，但是化疗后患者平均生存期仅为15个月，5年生存率仅为5%～20%。根据流行病学及监测数据，在过去的30年中膀胱癌患者的病死率未明显下降[1]。因此，需研发针对膀胱肿瘤的新的治疗药物。膀胱肿瘤发病涉及较多信号通路，其中成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)起着非常重要的作用。FGFR1基因扩增见于3%的膀胱肿瘤[2]，FGFR3基因扩增见于42%的膀胱肿瘤[3]，FGFR3突变见于15～50%的 膀胱肿瘤[3,4]。膀胱肿瘤中未见FGFR2和FGFR4基因扩增或突变[5]。以上数据说明，与FGFR家族其他成员比较，FGFR3在膀胱肿瘤发病中的作用更重要，是膀胱肿瘤治疗中的一个非常重要的靶点。本文就FGFR3在膀胱癌发病机制中的作用、目前靶向FGFR3治疗膀胱癌的应用作一综述。

1 FGFR3在膀胱癌发生中的作用研究

FGFR3是跨膜蛋白，属于FGFR家族成员之一，是Ⅰ型酪氨酸激酶受体。FGFR3基因位于4号染色体的p16.3上，有19个外显子。FGFR包含细胞外配体结合结构域、跨膜结构域和位于胞质内的酪氨酸激酶结构域。FGFR3通过选择性剪接形成的2个同源异构体FGFR3b和FGFR3c，分别表达于上皮细胞和间充质细胞。当成纤维母细胞生长因子(FGF)同2个FGFR3细胞外区域结合时，会调动2个FGFR3互相靠拢，导致FGFR3细胞内的酪氨酸激酶羧基末端互相磷酸化，激活下游蛋白(PLCγ、STATs、AKT、MAPK)，从而将细胞外信号传递到细胞内，促进细胞生长，血管形成。对接蛋白成纤维细胞受体底物2α(FRS2α)含有许多不同的磷酸化位点，在FGFR3激活过程中起重要作用。但如果FGFR3过度活跃，易导致肿瘤形成。有以下几种情况会导致FGFR3过度活跃。

1.1 FGFR3突变 FGFR3发生突变，自发形成二硫键，导致FGFR3持续性激活。FGFR3突变存在于75%的低级别非肌层浸润性膀胱乳头状癌及20%的肌层浸润性膀胱癌[6, 7]。最常见的突变是S249C，位于外显子7，导致249密码子半胱氨酸残基替代丝氨酸残基，多见于乳头状非肌层浸润性膀胱癌。突变导致二硫键形成，使受体二聚化，从而持续激活FGFR3[4]。R248C是FGFR3另外一种常见的突变，会导致FGFR3细胞外构象出现类似改变，从而激活FGFR3[4]。进展期尿路上皮癌组织中FGFR3突变的频率反而下降[7～9]。Ta期非肌层浸润性膀胱癌FGFR3突变频率为84%，T1期为21%，但肌层浸润性膀胱癌FGFR3突变频率则<15%[7,8]。Rebouissou等[10]发现，发生FGFR3突变的肌层浸润性膀胱癌患者通常伴有CDKN2A纯合性缺失。FGFR3突变常和预后相关[8,11]。而且在膀胱癌发病通路中最常见的2种情况为FGFR3突变或TP53突变[6]。

1.2 FGFR3基因易位和重组 有研究发现，除FGFR3突变外，FGFR3基因易位和重组也是FGFR3激活的机制[12～14]，FGFR3基因易位和基因重组导致FGFR3融合蛋白的形成。研究较多的是FGFR3与卷曲螺旋的酸性转化蛋白(TACC3)组成融合蛋白。多项研究证实，FGFR3-TACC3融合蛋白在胶质母细胞瘤、肺癌、膀胱癌、口腔癌、头颈部鳞状细胞癌、胆囊癌与宫颈癌发病中起重要作用[14～16]。正常情况下TACC3是FGFR3的上游基因。TACC3是TACC家族的成员之一。TACC家族蛋白对有丝分裂过程中的微管组织起关键作用。TACC家族有一个特别重要的结构域即C-末端的卷曲螺旋结构域(TACC域)，是一个高度保守域，有丝分裂期间此域在蛋白质定位中起重要作用[17]。TACC3与着丝点纤维及有丝分裂纺锤体的稳定起至关重要的作用。当4p16.3中TACC3和FGFR3两个基因反转，形成70 kb的串联重复，导致FGFR3-TACC3融合蛋白的形成[18]。由于FGFR3-TACC3融合是FGFR3酪氨酸残基磷酸化激活的关键因素之一，后者会导致MAPK信号通路的激活[14]。

1.3 FGFR3过度表达 50%的肌层浸润性膀胱癌组织存在FGFR3过度表达[3,19]。Gomez-Roman等[20]对22例不同分期的膀胱尿路上皮癌组织中FGFR3突变和过表达情况进行研究发现，与非肿瘤性膀胱组织比较，在pTa、pT1期膀胱肿瘤组织中FGFR3 mRNA过表达超过8倍，在pT2期FGFR3 mRNA过表达超过4倍，并且Western blotting和免疫组化法也进一步证实该结果。以上说明膀胱癌常存在FGFR3过表达。

2 FGFR3在膀胱癌靶向治疗中的作用研究

2.1 基因转染研究 基因转染研究证实，FGFR3在尿路上皮肿瘤细胞增殖中扮演重要角色，同时证实S249C和Y375C等特异突变对膀胱癌的发生发展有重要作用。1999年Cappellen等[4]第一次发现FGFR3基因具有致癌作用，尤其在膀胱癌中作用最为明显。同正常尿路上皮标本相比，膀胱癌组织标本突变的FGFR3 mRNA水平更高，而且最常见的突变是S249C[4]。美国国立卫生研究院(NIH)所建立的小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH-3T3细胞)稳定转染突变型FGFR3b-S249C，细胞增殖速度加快并失去接触抑制，能导致裸鼠成瘤；用siRNA转染技术也证实FGFR3-Y375C突变会导致FGFR3激活，但是转染野生型的FGFR3b不会导致裸鼠成瘤[21]。Tomlinsonet等[22]对97-7尿路上皮癌细胞株用shRNA基因沉默或再次表达S249C FGFR3会抑制或诱导细胞的肿瘤特性。Qing等[23]对野生型的FGFR3或突变型的FGFR3用siRNA敲低基因后，会降低细胞的增殖速度，导致S期和G2期细胞数目减少，G1期细胞增多，而凋亡指数是稳定的，显示出抑制细胞的效应，体内实验证实siRNA敲低FGFR3基因能抑制裸鼠RT112肿瘤的生长。以上说明FGFR3参与了膀胱癌发病过程。

2.2 中和性抗体 许多研究已尝试通过中和抗体靶向FGFR3[9,20,23～25]。Martinez-Torrecuadrada等[25]合成的人单链Fv抗体片段能识别膀胱癌RT112细胞株上的野生型及S249C突变型FGFR3，以剂量依赖的方式抑制RT112细胞增殖。其机制可能是阻断FGF-FGFR3的相互作用。Gomez-Roman等[20]也得出类似的结果。Qing等[23]研发的特异的FGFR3单克隆抗体(R3mAb)不仅能够抑制配体结合作用，还能够抑制野生型及各种突变型的FGFR3的二聚化，从而抑制膀胱癌RT112和RT4细胞株的增殖，抑制FGFR3及p42/44 MAPK的磷酸化。体内实验结果显示，5、50 mg/kg的R3mAb均能够抑制裸鼠FGFR3野生型RT112肿瘤生长，抑制率分别为41%、73%。R3mAb也能抑制裸鼠移植FGFR3突变型膀胱瘤的生长，而且R3mAb对裸鼠无明显的不良作用[23]。Gust等[9]研究发现，R3mAb可以抑制膀胱癌UM-UC1细胞株(高表达野生型FGFR3)和UM-UC14细胞株(FGFR3带有S249C突变)FGFR3磷酸化，可明显抑制细胞增殖，具有剂量依赖性；但用R3mAb处理高表达野生型FGFR3的RT4V6和RT112细胞株，其抑制作用不显著。腹腔注射R3mAb(30 mg/kg)能抑制UM-UC14、UM-UC1、RT112移植瘤生长，抑制肿瘤生长的机制在于抑制细胞增殖(Ki67指数下降)，而不是诱导细胞凋亡(裂解的Caspase-3表达无改变)[9]。

2.3 免疫毒蛋白 Martinez-Torrecuadrada等[26]将FGFR3特异性的Fv片段(3C)与重组白树毒素NH(2)端融合，大肠埃希菌产生的可溶性免疫毒蛋白能诱导FGFR3移位至核膜，从而导致RT112细胞凋亡。体内实验显示能将免疫缺陷小鼠的肿瘤体积缩小55%～70%，其作用机制可能为诱导细胞凋亡导致肿瘤缩小。

2.4 酪氨酸激酶抑制剂 目前研发的酪氨酸激酶抑制剂包括Dovitinib (TKI258/CHIR258)、BGJ398、AZD4547、PD173074和BMS-582664，均为小分子FGFR3及VEGFR2抑制剂。Lamont等[27]使用PD173074、TKI258和SUS5402小分子抑制剂在纳摩尔浓度水平(IC50)就能导致高表达FGFR3(不论FGFR3是否存在突变型)，但是Ras无突变(Ras无激活)的膀胱癌细胞株出现细胞周期阻滞和细胞凋亡，机制可能与抑制MAPK信号通路有关。但正常尿路上皮细胞及Ras突变(Ras激活)的膀胱癌细胞株不会受PD173074、TKI258和SUS5402小分子抑制剂的影响。裸鼠体内实验显示上述小分子抑制剂能推迟肿瘤生长，没有明显的毒性作用。免疫组化结果显示该小分子抑制剂抑制肿瘤生长的机制为抑制细胞增殖，而不是诱导细胞凋亡。Guagnano等[28]用BCJ398酪氨酸激酶抑制剂也能抑制裸鼠RT112细胞株移植瘤的生长。Hanze等[29]用Dovitinib处理10个不同的膀胱癌细胞株，并检测上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)和神经钙黏素(N-cadherin)mRNA表达，发现IC50同细胞株上皮细胞间质转型的状态相关，因此E-cadherin、N-cadherin可预测膀胱癌细胞株对Dovitinib治疗的反应。但Miyake等[30]用PD173074处理不同的尿路上皮癌细胞株，结果发现PD173074只对FGFR3突变型的细胞株有效，可致其凋亡。体内实验进一步证实，PD173074能抑制裸鼠UM-UC14和MGHU3细胞株移植瘤(FGFR3突变型)的生长，其机制在于PD173074能诱导细胞凋亡。

FGFR3激活性突变见于75%的非肌层浸润性膀胱癌，FGFR3过表达见于50%的肌层浸润性高级别膀胱癌。敲除突变的FGFR3基因可以抑制膀胱癌细胞株的增殖、集落形成和浸润能力，体内实验结果也证实突变型FGFR3是癌基因。单克隆抗体靶向野生型和突变型FGFR3能抑制膀胱癌细胞株和移植瘤的生长，部分酪氨酸激酶抑制剂进入了临床试验阶段。将来FGFR3靶向药物可用于膀胱癌的治疗。