子宫肌瘤组织中miR-23、孕激素受体蛋白表达变化及意义

刘烜，欧阳江华，林慧，郝娟

(1青岛市妇女儿童医院，山东青岛266034；2青岛市海慈医疗集团)

子宫肌瘤亦称子宫平滑肌瘤，是由子宫平滑肌细胞增生而成，是一种常见的良性肿瘤。目前治疗以手术为主，药物治疗则局限于控制症状与术前准备[1]。目前认为子宫肌瘤是一种激素依赖型肿瘤，受雌激素、催乳素、孕激素等激素调控[2]。微小RNA(microRNA)是一类小分子的非编码的RNA，通常长约21～23个核苷酸，其主要生理作用是调节基因的表达[3]。microRNA对相应基因的调控通常不是“开-关”样作用，而是通过调整细胞对各种生长因子、形态因子的应答反应，达到调控细胞生长、凋亡的目的[4]。因此microRNA对不同组织不同细胞的调节作用也不尽相同。microRNA-23(miR-23)隶属于microRNA-23-27-24基因簇，已被证实在前列腺癌、肝癌等肿瘤细胞中异常表达，且与细胞增殖、分化、侵袭、迁移等密切相关[5]。但miR-23在子宫平滑肌细胞中的作用，尤其是对子宫肌瘤组织中孕激素受体的作用尚不明确。本研究测定子宫肌瘤组织、肌瘤胞膜外肌层组织和正常子宫平滑肌层组织中miR-23的表达，同时检测孕激素受体(PR)的两种亚型蛋白(PRA、PRB)的表达，以期探明miR-23在子宫肌瘤中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2010年9月～2015年5月本院妇科收治的子宫肌瘤患者83例，年龄39～56(40.12±8.21)岁；术后均经病理检查确诊为单纯子宫平滑肌瘤(增生期)；月经规律，无其他严重并发症；剔除非单发子宫肌瘤，内分泌异常，近3个月内应用激素类药物，月经不调，合并其他严重代谢性疾病；经全子宫切除术、次全子宫切除术取得子宫肌瘤组织、肌瘤胞膜内外各1 cm处组织，于-80 ℃冰箱中储存。选择同期确诊为单纯子宫脱垂患者27例，年龄41～53(41.35±5.17)岁，均处于子宫内膜增生期；行子宫切除术取得子宫肌层组织作为对照，于-80 ℃冰箱中储存。子宫肌瘤患者、子宫脱垂患者年龄具有可比性。本研究经患者及其家属知情同意，经本院伦理协会批准。

1.2 组织中miR-23表达检测 采用RT-PCR法。将保存的组织标本取出，PBS冲洗2次，按照TRIzol总RNA试剂盒(上海名劲生物科技有限公司)说明提取总RNA。紫外分光光度计检测其纯度，取OD260/OD280值控制在1.8～2.0的样本，按PrimeScriptTm反转录试剂盒(上海名劲生物科技有限公司)使用说明，将提取的总RNA逆转录为cDNA。反应结束后将合成的cDNA样品稀释后置于冰上保存。RT-PCR反应以U6 snRNA为内参。引物购自上海名劲生物科技有限公司。U6 snRNA的上游引物为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23上游引物为5′-TCACACTATATCACATTGCCAGG-3′，下游引物为5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性12 s，经60 ℃退火及延伸45 s，以上循环40次。以2-ΔΔCt法计算miR-23的相对表达量。

1.3 孕激素受体蛋白表达检测 采用Western blotting法。将保存的组织标本取出，PBS冲洗2次，加入RIPA裂解液(上海远慕生物科技有限公司)充分裂解，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min，取上清液，-80 ℃沉淀24 h以纯化蛋白。将待测蛋白液转移至PVDF膜(上海远慕生物科技有限公司)，5%脱脂奶室封闭2 h，与兔抗人PRA、PRB单克隆抗体(一抗，美国Santa Cruz公司)杂交，4 ℃水平摇床过夜，TBST漂洗3次，与鼠抗兔多克隆抗体(二抗，美国Santa Cruz公司)杂交，室温，水平摇床轻摇2 h孵育。漂洗3次，压片、曝光，显影、定影。用Image Master 2D platinum 7.0进行图像处理，蛋白的相对表达量以待测蛋白与内参GAPDH的灰度值比值表示。

2 结果

2.1 不同组织中miR-23表达比较 子宫肌瘤组织、肌瘤胞膜外子宫肌层组织及正常肌层组织中miR-23相对表达量分别为0.985±0.418、2.198±0.822、2.509±1.220。与肌瘤胞膜外子宫肌层组织及正常肌层组织比较，子宫肌瘤组织中miR-23相对表达量低(t分别为11.984、9.817，P均<0.05)，肌瘤胞膜外子宫肌层组织与正常肌层组织中miR-23相对表达量比较差异无统计学意义(t=1.504，P=0.136)。

2.2 不同组织中PRA、PRB蛋白表达比较 子宫肌瘤组织、肌瘤胞膜外子宫肌层组织及正常肌层组织中PRA、PRB蛋白相对表达量分别为0.465±0.182、0.196±0.212、0.160±0.127，PRB蛋白相对表达量分别为0.699±0.068、0.302±0.042、0.161±0.037。与肌瘤胞膜外子宫肌层组织及正常肌层组织比较，子宫肌瘤组织中PRA、PRB蛋白相对表达量高(tPRA分别为8.771、8.079，tPRB分别为45.253、39.185，P均<0.05)，肌瘤胞膜外子宫肌层组织与正常肌层组织中PRA蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(t=0.833，P=0.406)，肌瘤胞膜外子宫肌层组织中PRB蛋白相对表达量高于正常肌层组织(t=15.579，P=0.000)。

2.3 子宫肌瘤组织中miR-23与孕激素受体蛋白表达的相关性 Spearman相关分析结果显示，子宫肌瘤组织中miR-23与PRA蛋白表达呈负相关(rs=-0.225，P=0.041)，miR-23与PRB蛋白表达无相关性(rs=-0.063，P=0.571)，PRA蛋白与PRB蛋白表达无相关性(rs=0.101，P=0.364)。

3 讨论

子宫肌瘤是临床发病率极高的良性肿瘤。目前子宫肌瘤的具体发病机制仍不清楚。临床“孕激素假说”认为，孕激素能够促进子宫平滑肌细胞有丝分裂，抑制子宫平滑肌细胞凋亡，因此是子宫肌瘤发病的关键[6]。雌激素类药物临床应用广泛，其对子宫肌瘤的治疗效果已得到证实，可通过特定信号通路上调孕激素受体蛋白的表达，从而控制子宫肌瘤的发展[7]。孕激素受体蛋白一般分为PRA、PRB两种亚型。本研究中，子宫肌瘤组织中PRA、PRB两种亚型蛋白均在子宫肌瘤组织中高表达，而在肌瘤胞膜外子宫肌层和正常肌层中低表达，这与孕激素假说吻合，提示孕激素受体蛋白的高表达促进子宫肌瘤的发生发展。而PRA、PRB两种受体蛋白在子宫肌瘤组织中的表达并无相关性，提示二者可能通过不同的途径影响子宫肌瘤，并无拮抗或协同作用。

microRNAs作为人体的内生非编码RNA，近年来，因在转录后加工这一基因层面参与机体各方面病理生理进程而成为研究的热点[8]。本研究miR-23即为其中之一。miR-23对机体的调节体现在多组织、多方面。Lin等[9]研究发现，miR-23对少突胶质细胞的发育和髓鞘的形成至关重要。Di等[10]则通过检测冠心病患者血浆miR-23的表达，发现血液中miR-23的表达升高往往意味着心血管系统疾病的发生；而敲除血管内皮细胞中的miR-23基因后，不仅血管内皮生长因子的水平得到恢复，病理性的血管新生同时得到了抑制。Yang等[11]研究发现，miR-23通过下调X连锁凋亡抑制蛋白在卵巢粒细胞中的表达，而调控粒细胞的凋亡进程，从而促进卵巢早衰。本研究发现，miR-23在子宫肌瘤组织中同样异常表达，其表达较子宫肌瘤胞膜外肌层组织与正常肌层组织低，提示miR-23可能发挥抑癌基因功能，参与子宫肌瘤的发生与发展进程。另外，miR-23的表达与PRA蛋白的表达呈负相关，提示低表达的miR-23可能促进PRA蛋白的表达，从而促进子宫肌瘤的发生发展。因此可以推测miR-23与抑制PRA蛋白表达的信号通路有关。而miR-23的表达与PRB蛋白的表达无明显相关性，提示两者可能通过不同的途径影响子宫肌瘤的发生发展。

综上所述，miR-23在子宫肌瘤组织中异常表达，并可能通过特定途径影响PRA蛋白的表达，从而参与子宫肌瘤的发生发展。而PRB蛋白与miR-23、PRA蛋白的影响途径应当不同。具体的作用机制与途径尚需进一步的研究探索。