发作期哮喘患儿外周血单个核细胞中miR-206表达变化及意义

钱琴芬，熊建新，朱琳，顾猛

(常州市儿童医院，江苏常州213003)

哮喘是呼吸系统一类复杂的异质性炎症性疾病，近年来其发病率逐年上升[1]。目前，全球范围内约有3亿哮喘患者，而据WHO估计，至2025年哮喘患者将新增1个亿，其中小儿哮喘所占比例将由3%提高至38%[2]。导致哮喘的细胞包括肥大细胞、嗜酸性细胞与淋巴细胞，且淋巴细胞中的辅助性T细胞(Th细胞)起主要作用[3]。微小RNA(microRNA)是一类长度为20～24核苷酸的RNA，由microRNA调控的基因近来被证实与Th细胞的生长发育及功能关系密切[4]。有研究证明，miR-206的基因位点与白细胞介素17a(IL-17a)、IL-17b的相毗邻[5]。而IL-17是一种由Th17细胞分泌的细胞活性物质，其已被证实参与机体内的多种炎症反应，包括类风湿性关节炎[6]、系统性红斑狼疮[7]与多发性硬化[8]等。本研究检测外周血单个核细胞(PBMCs)中miR-206、IL-17 mRNA表达，以探讨miR-206在小儿哮喘发病中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年9月～2017年10月本院儿科门诊及病房治疗的哮喘患儿43例，男25例、女18例，年龄3～14(7.13±1.59)岁。患儿纳入标准：符合中华医学会制定的《支气管哮喘防治指南(2016年版)》[9]标准，且于急性发作期就诊；就诊前1个月内未全身应用糖皮质激素类药物，且72 h内未应用其他平喘药物；未合并严重感染或其他严重疾病；未发生荨麻疹、过敏性鼻炎等。将患儿按照《支气管哮喘防治指南(2016年版)》[9]标准进行分级，一级、二级设为轻度组，三级、四级设为重度组。其中轻度组18例、重度组25例。同期选取30例健康儿童作对照，男15例、女12例，年龄4～14(7.50±1.08)岁。各组年龄、性别具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，患儿家属知情同意。

1.2 PBMCs分离及提取 患儿入院3 d内喘息、咳嗽、气促、胸闷等症状未明显缓解则视为急性发作期，经治疗3～9 d症状明显缓解或消失，则视为缓解期。分别于急性发作期、缓解期清晨抽取患儿空腹静脉血5 mL，对照组于查体时抽取等量空腹静脉血，加入肝素(50 U/mL)抗凝。用Ficoll-Hypaque分离液(行知生物科技有限公司)分离提取PBMCs，调整细胞为2×106/L，接种于24孔细胞培养板，加入植物血凝素，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养72 h，2 000 r/min离心10 min，收取上清液，冷藏备用。

1.3 PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表达检测 用qRT-PCR法。用TakaraTMreagent Kit(Perfect Real Time,行知生物科技有限公司)将上述制得的PBMCs样本中的总RNA逆转录为cDNA，以U6为miR-206内参，β-actin为IL-17 mRNA内参，用2-ΔΔCt法计算相对表达量。miR-206正向引物：5′-GGCCGCTGGAATGTAAGGAAG-3′，反向引物：5′-CTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6正向引物：5′-GTGGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物：5′-GTAACGCTT CACGAATTTGCGTGTC-3′；IL-17 mRNA正向引物：5′-TGAGAGTTGACATTCGCATCTT-3′，反向引物：5′-GATACAGCCTGAGTGTCTGCAC-3′；β-actin正向引物：5′-CACGAAACTACCTTCAACTCC-3′，反向引物：5′-CATACTCCTGCTTGCTGATCT-3′。引物均由行知生物科技有限公司合成。

2 结果

2.1 哮喘患儿与健康儿童PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表达比较 健康儿童PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA分别为0.211±0.037、0.074±0.019，哮喘患儿缓解期分别为0.208±0.067、0.082±0.018，哮喘患儿发作期分别为0.051±0.011、0.621±0.185。与健康儿童比较，哮喘患儿发作期PBMCs中miR-206相对表达量低、IL-17 mRNA相对表达量高(t分别为26.781、16.102，P均<0.05)，而哮喘患儿缓解期PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA相对表达量与健康儿童比较差异无统计学意义(t分别为0.222、1.826，P均>0.05)。

2.2 哮喘患儿发作期PBMCs中miR-206与IL-17 mRNA表达的相关性 Pearson相关性分析结果显示，哮喘患儿发作期PBMCs中miR-206与IL-17 mRNA相对表达量呈负相关(r=-0.960，P<0.05)。

2.3 哮喘急性发作病情严重程度与PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表达的关系 轻度组PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA相对表达量分别为0.061±0.008、0.465±0.132，重度组分别为0.048±0.012、0.672±0.158。Spearman秩相关分析结果显示，哮喘患儿病情严重程度与miR-206表达呈负相关(rs=-0.592，P<0.05)，与IL-17 mRNA表达呈正相关(rs=0.601，P<0.05)。

3 讨论

哮喘是一种难以根治的可逆的阻塞性呼吸道疾病，一般包括慢性炎症性反应与气道高敏反应，表现为咳嗽、喷嚏、鼻塞、鼻痒、流涕、肺部哮鸣音、胸闷、气喘等[10]。引起哮喘急性发作的原因多种多样，包括且不限于过敏反应、继发性感染、职业暴露、特定药物的应用、脉管炎乃至体育锻炼[11,12]。哮喘种类繁多，具有异质性。目前的诊断手段尚无法将不同的哮喘种类明确区分，为制订个体化治疗方案、根治哮喘造成了极大的阻碍。因此急需一种非侵入性的新型诊断手段以改善哮喘的临床诊疗方案、了解哮喘的病因病理。本研究选取microRNAs为观察指标，通过检测儿童PBMCs中miR-206与IL-17 mRNA表达，探究哮喘患儿PBMCs中的miR-206是否可作为小儿哮喘的特异性生物标记物。

microRNAs是一类非编码单股RNA，通过与Argonaute家族蛋白结合，microRNAs能够参与形成有活性的RNA诱导沉默复合体，沉默目标mRNA[13]，从而调节相应细胞因子表达，进而参与机体多种病理生理进程[14]。近来有研究证实microRNAs参与淋巴细胞的终末分化过程[15]。其中，miR-206被认为与骨肉瘤细胞的发生发展[16]或机体激素分泌[17]相关。但miR-206与炎症性疾病的关系目前尚不明确。本研究发现哮喘患儿发作期PBMCs中miR-206表达低，同时伴随IL-17 mRNA表达上调；而哮喘患儿缓解期PBMCs中miR-206、IL-17 mRNA表达与健康儿童并无差异。且miR-206的表达与患儿病情严重程度呈负相关，即miR-206表达低的患儿病情更为严重。

IL-1是由Th17细胞(即CD4阳性细胞)分泌的一种细胞因子[18]。IL-17可诱导IL-6、前列腺素E2的分泌，T细胞增殖与分化[19,20]。目前认为IL-17表达上调与多种炎症性疾病密切相关[6～8]。IL-17能够刺激气道平滑肌分泌嗜酸细胞活化趋化因子，同时诱导人嗜酸性细胞分泌炎症性介质[21，22]。Agache等[23]研究发现，血液内IL-17表达上调，预示着哮喘病情恶化，发作剧烈。本研究发现，哮喘患儿发作期PBMCs中IL-17水平较健康儿童高，而哮喘患儿缓解期PBMCs中IL-17水平则回落至正常水平。而之后的Spearman回归分析结果显示，PBMCs中IL-17水平与哮喘患儿急性发作期的病情严重程度呈正相关。本研究结果显示，哮喘患儿发作期PBMCs中miR-206与IL-17 mRNA表达呈负相关，因此推测miR-206参与小儿哮喘的机制可能与IL-17相关。miR-206可能参与构成IL-17 mRNA为沉默目标的RNA诱导沉默复合体。因此当miR-206表达受到抑制，IL-17水平即随之上升，从而引发严重的哮喘症状。但此推论尚需进一步研究证明。

综上所述，本研究发现，发作期哮喘患儿PBMCs中miR-206呈低表达，miR-206表达水平与IL-17 mRNA表达呈负相关，提示miR-206可能通过IL-17 mRNA相关通路参与小儿哮喘急性发作的发生发展。